楊興坤，周曉強(qiáng)，杜佳月，吳水娟，陳淑芬，朱曉丹，李 超，周雅思，郭明娟

(1.佛山市婦幼保健院胎兒研究所婦女兒童醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 佛山 528000；2.佛山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東 佛山 528000)

胎兒頸部透明層(nuchal translucency，NT)指胎兒頸椎水平矢狀切面皮膚至皮下軟組織之間的最大厚度，反映在影像圖上即為胎兒頸后皮下組織內(nèi)無(wú)回聲帶。胚胎在淋巴系統(tǒng)健全之前，少部分淋巴液積聚在淋巴囊或淋巴管形成NT。NT 增厚與胎兒染色體異常和胎兒結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)，并且染色體異常的發(fā)生率隨著NT厚度的增加而升高[1]。

研究表明，NT增厚除了跟胎兒染色體非整倍體有關(guān)外，還跟染色體微缺失/微重復(fù)綜合征密切相關(guān)[2]。目前，細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是染色體核型分析，但其分辨率有限，僅能檢出5～10 Mb以上的染色體結(jié)構(gòu)異常，并且需要人工操作的步驟較多，檢測(cè)周期長(zhǎng)，可能因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)失敗而無(wú)法獲得核型分析結(jié)果[3]。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)不能檢測(cè)染色體拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)，臨床上檢測(cè)CNVs的常用技術(shù)是染色體微陣列分析技術(shù)和DNA高通量測(cè)序技術(shù)[4-7]。

目前，對(duì)于僅有NT 增厚單一指標(biāo)胎兒的研究比較少，且不同程度NT增厚和染色體CNVs的關(guān)系尚不明確。因此，本研究收集了514 例孕婦，對(duì)胎兒絨毛或羊水同時(shí)進(jìn)行核型分析和或DNA高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)，通過(guò)比較染色體異常檢出率的差異，分析不同NT值胎兒進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷的必要性，以及不同程度NT增厚的胎兒，是否有必要同時(shí)行染色體核型分析和染色體拷貝數(shù)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017 年1 月—2022 年5 月在佛山市婦幼保健院進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷且符合以下條件孕婦514 例為研究對(duì)象：①單胎；②夫婦無(wú)地中海貧血；③預(yù)產(chǎn)期年齡≥35 歲(高齡)或單純NT 增厚不伴發(fā)結(jié)構(gòu)畸形且預(yù)產(chǎn)期年齡＜35 歲。將單純因“高齡”進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦228 例分為A 組，2.5 mm≤NT＜3.0 mm 不伴結(jié)構(gòu)畸形且非高齡孕婦106 例分為B 組，NT≥3.0 mm 不伴結(jié)構(gòu)畸形且非高齡孕婦180 例分為C 組。A 組年齡為(39.0±2.8)歲，B組年齡為(28.0±3.7)歲，C組年齡(28.0±3.8)歲。

1.2 標(biāo)本采集及處理

按照常規(guī)手術(shù)操作規(guī)范，每位孕婦抽取羊水30 mL，分裝于3 支無(wú)菌離心管內(nèi)，每管約10 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 染色體核型分析

將20 mL 羊水樣本1 140 g 離心8 min 后，取沉淀細(xì)胞分別接種于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，每瓶含5 mL羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州達(dá)暉)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma 3111 型)中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d 后收獲細(xì)胞，進(jìn)行染色體制備及G 顯帶，步驟如下：羊水細(xì)胞1 370 g 離心6 min，棄上清，留約0.1 mL；37 ℃低滲5 min，加1 mL固定液(甲醇∶冰醋酸體積比=3∶1)預(yù)固定；1 370 g 離心6 min，去上清，加入6 mL 固定液(同前)固定兩次；1 370 g 離心6 min，去上清液，加入新鮮固定液(同前)3～4 滴，氣泡沖勻，即可進(jìn)行滴片。滴2 滴已混勻的細(xì)胞懸液于冰水浸過(guò)的玻片上，70 ℃烤片機(jī)上烤干，烤干后放入60 ℃烤箱，過(guò)夜。從烤箱中取出玻片，放至室溫。放入消化液中作用10～20 s 取出，蒸餾水漂洗。Giemsa染液染色2～5 min，用自來(lái)水沖洗，晾干。采用德國(guó)徠卡GSL-120全自動(dòng)掃描儀進(jìn)行掃描，應(yīng)用自興AI分析軟件(Release MCA 2.4)進(jìn)行分析。常規(guī)計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，分析5 個(gè)核型，嵌合體時(shí)計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析診斷。

1.4 羊水DNA高通量測(cè)序分析

取10 mL 羊水樣本采用DNeasy Blood and Tissue Kit(德國(guó)QIAGEN 公司)提取羊水中細(xì)胞DNA，提取步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。然后采用染色體CNVs 檢測(cè)試劑盒(北京貝瑞和康公司，KR2000)，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。即將50 ng 全基因組DNA 隨機(jī)消化為180 bp左右的片段，采用酶反應(yīng)方法將打斷后的DNA小片段末端補(bǔ)平，連接接頭；采用磁珠純化的方法進(jìn)行片段選擇和純化，從而得到DNA文庫(kù)。由北京貝瑞和康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司在Illumina Next Seq500測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。本檢測(cè)僅針對(duì)片段大小為100 kb 以上的CNVs 進(jìn)行致病性分析，CNVs 的臨床意義參考2015 版美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American Society of Medical Genetics and Genomics，ACMGG)的遺傳變異分類[8]。對(duì)于CNVs 測(cè)序數(shù)據(jù)的解釋，通過(guò)檢索以下公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行：DGV(http://dgv.tcag.ca/)；DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)和OMIM(http://omim.org/)。將CNVs 分為3類：良性CNVs(benign CNVs，bCNVs)、致病性未知CNVs(variants of uncertain significance CNVs，VUS CNVs)及致病性CNVs(pathogenic CNVs，pCNVs)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，采用卡方檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染色體核型和拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

514例樣本，共檢測(cè)出非整倍體42例(8.17%)，致病性CNVs 8 例(1.56%)，意義不明突變10 例(1.95%)。在高齡組的228 例中，檢測(cè)出非整倍體6 例(2.63%)，致病性CNVs 3 例(1.32%)，意義不明的突變5 例(2.19%)，214 例未見(jiàn)異常；在2.5 mm≤NT＜3.0 mm 組的106例中，檢測(cè)出非整倍體5例(4.72%)，101例未見(jiàn)異常；在NT≥3.0 mm組的180例中，檢測(cè)出非整倍體31 例(17.22%)，致病性CNV5 例(2.78%)，意義不明的CNVs 5 例(2.78%)。染色體核型和拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，18例有臨床意義的CNVs測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 514例樣本染色體核型和拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

表2 18例有臨床意義的樣本CNVs測(cè)序結(jié)果

2.2 染色體非整倍體及有臨床意義CNVs 檢出率的比較

結(jié)果見(jiàn)表3。比較高齡組(A 組)、非高齡且不合并結(jié)構(gòu)異常，2.5 mm≤NT ＜3.0 mm 組(B 組)和NT≥3.0 mm 組(C 組)組間非整倍體及致病性CNVs 檢出情況的差異，結(jié)果表明3 組間總體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.920，P＜0.01)；A 組和B 組間非整倍體檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而C組非整倍體檢出率高于A組和B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。有臨床意義的CNVs(包括致病性和意義不明CNVs)檢出率在A組和B 組、A 組和C 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而C組高于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 非整倍體和有臨床意義的CNVs檢出情況的比較

3 討 論

目前，關(guān)于NT 增厚的截?cái)嘀狄恢贝嬖跔?zhēng)議，臨床上一般將NT≥3.0 mm 或NT≥3.5 mm 視為NT 增厚[9-11]，有研究提出根據(jù)第99 百分位NT 值即3.5 mm來(lái)判定是否存在NT 增厚[1，12]，也有研究認(rèn)為NT 的截?cái)嘀刀?.0 mm[13]，NT 厚度為2.5～2.9 mm 定為臨界厚度較為合理[14]。另外，對(duì)于胎兒2.5 mm≤NT＜3.0 mm 的孕婦是建議進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷還是無(wú)創(chuàng)性非整倍體篩查，以及這部分胎兒是否需要在檢測(cè)染色體非整倍體的同時(shí)檢測(cè)染色體CNVs 是臨床爭(zhēng)議的重點(diǎn)。因?yàn)榻槿胄援a(chǎn)前診斷有一定的流產(chǎn)、宮內(nèi)感染等不可避免的風(fēng)險(xiǎn)，并且染色體CNVs 檢測(cè)的費(fèi)用相對(duì)昂貴。然而，目前針對(duì)這部分人群進(jìn)行的研究較少，并且現(xiàn)有研究未去除主要混雜因素[15-16]，因此本文重點(diǎn)針對(duì)這部分人群進(jìn)行了探討，并且去除了高齡及胎兒結(jié)構(gòu)異常這兩個(gè)主要混雜因素。

國(guó)內(nèi)有研究針對(duì)1 461 例高齡孕婦進(jìn)行基因組拷貝數(shù)分析，結(jié)果顯示，致病性染色體異常樣本檢出率為2.33%(34/1 461)[17]，而本研究中高齡組染色體致病性染色體異常檢出率為3.95%，較文獻(xiàn)報(bào)道高1.62%，可能和抽樣誤差有關(guān)。另《中華人民共和國(guó)母嬰保健法實(shí)施辦法》中明確規(guī)定：預(yù)產(chǎn)期年齡超過(guò)35歲的孕婦，醫(yī)師應(yīng)當(dāng)對(duì)其進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷。因此，在本研究中，設(shè)置了單純高齡組作為對(duì)照組，單純NT 增厚組(非高齡且不合并結(jié)構(gòu)異常，B 和C 組)作為實(shí)驗(yàn)組，比較不同程度NT 增厚在非整倍體和有臨床意義CNVs 檢出情況是否存在差異，這樣就排除了孕婦高齡因素及胎兒結(jié)構(gòu)異常對(duì)NT 增厚的影響，得到的結(jié)果更客觀地反映了不同NT 厚度胎兒染色體異常的情況。本研究研究結(jié)果顯示，2.5 mm≤NT＜3.0 mm 組非整倍體檢出率(4.72%)和高齡組(2.63%)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明2.5 mm≤NT＜3.0 mm的非整倍體發(fā)生率和高齡人群相當(dāng)，很有必要進(jìn)行胎兒染色體核型分析。NT≥3.0 mm 組(180 例)的非整倍體檢出率為17.22%，其檢出率明顯高于高齡組和2.5 mm≤NT＜3.0 mm 組(P＜0.05)，應(yīng)當(dāng)建議其進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷。因此，隨著NT 值增加，染色體非整倍體的發(fā)生概率也隨之增加，本結(jié)果與其他研究一致[18-19]。

在本研究中，2.5 mm≤NT＜3.0 mm 組的孕婦未檢測(cè)出致病變異或致病性未知CNVs，高齡組致病變異或致病性未知CNVs的檢出率3.51%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。然而，NT≥3.0 mm 組中致病變異或致病性未知CNVs 的檢出率為5.56%，顯著高于2.5 mm≤NT＜3.0 mm 組(P＜0.05)。因此，2.5 mm≤NT＜3.0 mm組的孕婦不一定需要同時(shí)檢測(cè)染色體CNVs，但要跟孕婦交代殘余風(fēng)險(xiǎn)；而對(duì)NT≥3.0 mm組，應(yīng)建議同時(shí)檢測(cè)染色體非整倍體及CNVs。

另外，本研究中共8例檢出9個(gè)pCNVs，其中有3例檢出16p13.11 微重復(fù)綜合征相關(guān)的pCNVs，該綜合征所在重復(fù)區(qū)域?yàn)樯窠?jīng)認(rèn)知障礙(自閉癥、智力障礙、多發(fā)性先天畸形)易感區(qū)，患兒可能表現(xiàn)出行為異常、發(fā)育遲緩、先天性心臟病、骨骼異常等。還有3 例檢測(cè)出與22q11 重復(fù)綜合征相關(guān)的片段重復(fù)，該綜合征存在外顯不全的情況，患兒表型從正?；驇缀跽５絿?yán)重，變化較大。此綜合征最常見(jiàn)的臨床癥狀有智力障礙(97%)、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯(67%)、生長(zhǎng)受限(63%)等。另外，22q11 重復(fù)綜合征患者可表現(xiàn)出不同程度的DiGeorge 綜合征(DGS)或腭心面綜合征(velocardio- facial syndrome，VCFS)表型如腭咽發(fā)育不全、腭裂、先天性心臟病、耳聾、腎生殖系統(tǒng)畸形、胸腺缺如、無(wú)脾、認(rèn)知障礙等。還有1 例檢測(cè)到1 號(hào)染色體q21.1 至q21.2 區(qū)域重復(fù)0.86 Mb，該片段重復(fù)相關(guān)的疾病為1q21.1微重復(fù)綜合癥，重復(fù)片段包含該綜合癥的關(guān)鍵基因GJA5，GJA8，此綜合癥有外顯不全的情況，患者可從正常到不同程度的智力障礙、輕度特殊面容、心臟結(jié)構(gòu)異常、癲癇、脊柱彎曲、輕度生殖器異常和自閉癥等臨床癥狀。另有1 例檢出兩個(gè)pCNVs：Xp2.31 缺 失1.58 Mb 和10q26.13-q26.3 缺失9.52 Mb，X染色體p22.31處缺失區(qū)域，包含類固醇硫酸鹽(steroid sulphatase，STS)基因的全部，該基因的缺失與類固醇硫酸酯酶缺乏癥相關(guān)，為X染色體隱性遺傳，男性患者主要表現(xiàn)為皮膚異常(魚鱗癬)，部分女性攜帶者在臂及脛前可見(jiàn)輕度鱗屑。10 號(hào)染色體q26.13-q26.3處缺失9.52 Mb區(qū)域，覆蓋了10q26缺失綜合征約60%區(qū)域。該綜合征患者主要的臨床表現(xiàn)為特殊面容、身材矮小、智力障礙、發(fā)育遲緩，隱睪癥(男)和張力減退等。另外，值得一提的是，此例患者在染色體核型分析中發(fā)現(xiàn)10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂大片段缺失，在高通量測(cè)序分析中除了檢測(cè)到該缺失外，還檢測(cè)到X染色體上存在另一個(gè)致病性缺失片段，這說(shuō)明染色體不同部位大片段異常和微缺失/微重復(fù)可同時(shí)存在，單純行染色體核型分析可能會(huì)漏診微缺失微重復(fù)異常。因此，如果臨床上發(fā)現(xiàn)一些先證者，染色體核型異常不能很好地解釋臨床表現(xiàn)時(shí)，有必要進(jìn)一步進(jìn)行染色體CNVs的檢測(cè)?？傊@9個(gè)pCNVs中的7例與心臟發(fā)育相關(guān)，此結(jié)果與已有研究結(jié)果相符：胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常可引起頸靜脈血流發(fā)生不同程度的變化，導(dǎo)致靜脈血流受阻，造成頸靜脈壓力升高，進(jìn)而發(fā)生頸淋巴管回流障礙，多余的淋巴液聚集于頸項(xiàng)部，從而造成NT增厚[20]。

此外，本研究共檢出10 例不確定意義變異(VUS CNVs)胎兒，即依據(jù)目前對(duì)人類基因組的了解和現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法準(zhǔn)確解釋的基因組變異，無(wú)足夠證據(jù)來(lái)確定其臨床意義，有待于在以后的研究中明確其致病性[21]。這10 例不確定意義變異病例中，9 例活產(chǎn)，另外1 例選擇了引產(chǎn)，活產(chǎn)病例隨訪未發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常，這就提示我們，對(duì)于意義不明的病例，需要專業(yè)的遺傳咨詢醫(yī)生和孕婦及其家屬充分溝通，建議孕婦及其丈夫進(jìn)行染色體CNVs 檢測(cè)，明確胎兒染色體微缺失來(lái)源，充分評(píng)估變異可能的風(fēng)險(xiǎn)，避免不必要的引產(chǎn)，另外對(duì)意義不明變異胎兒出生的隨訪也很重要，可以幫助臨床醫(yī)生積累更多可靠資料，為相關(guān)遺傳變異的遺傳咨詢提供依據(jù)。

綜上所述，NT厚度目前作為孕早期產(chǎn)檢常規(guī)項(xiàng)目之一，是篩查嚴(yán)重致畸致殘性疾病的重要指標(biāo)。對(duì)發(fā)現(xiàn)NT 增厚的胎兒，如果不合并其他高危因素，應(yīng)根據(jù)NT厚度，為孕婦提出合理的進(jìn)一步檢測(cè)建議。