滕 婧,楊 柳

(1.湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢 430061;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,湖北 武漢 430061;3.湖北省中醫(yī)藥研究院,湖北 武漢 430074)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種比較常見的女性生殖系統(tǒng)功能異常性疾病[1]。目前在全世界生育期女性中的發(fā)病率為5%～20%[2]。PCOS臨床表現(xiàn)包括月經(jīng)先后無定期、月經(jīng)稀少或閉經(jīng)、毛發(fā)增多、痤瘡、體重增加等癥狀,常伴發(fā)高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病[3]。研究提示,PCOS發(fā)病機(jī)制與炎癥反應(yīng)存在關(guān)聯(lián),腫瘤壞死因子等炎癥指標(biāo)升高會(huì)影響性激素水平,甚至抑制排卵[4-5]。PCOS是導(dǎo)致不孕的常見原因,其中70%無排卵型不孕均由該病引起,對(duì)年輕女性的生活及心理狀態(tài)造成了極大的影響[6]。目前西醫(yī)多采用促排卵、抗雄激素等藥物治療,能快速改善上述癥狀,但長時(shí)間使用有較多不良反應(yīng)[7]?！抖嗄衣殉簿C合征相關(guān)不孕治療及生育保護(hù)共識(shí)》[8]認(rèn)為針刺療法具有調(diào)月經(jīng)、促排卵作用,可用于治療PCOS,然而單獨(dú)使用療效有限。中醫(yī)認(rèn)為痰濕是引起PCOS的重要原因[9],本科室據(jù)此擬定祛濕化痰方聯(lián)合針刺治療PCOS。微小RNA是體內(nèi)的一種小分子RNA,其中血清miR-223、miR-181a能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),在肺炎、膿毒血癥等多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[10-11],但二者與PCOS的關(guān)系尚未報(bào)道。因此,本研究擬探討祛濕化痰方聯(lián)合針刺治療脾虛痰濕型PCOS的療效,通過多因素Logistic回歸和ROC曲線分析miR-223、miR-181a對(duì)PCOS治療后能否妊娠的預(yù)測(cè)價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月于湖北省中醫(yī)院就診的90例PCOS患者,隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組,每組45例。對(duì)照組平均年齡(29.12±4.18)歲,平均體重指數(shù)(23.75±5.31)kg/m2,平均病程(3.37±0.52)年。觀察組平均年齡(29.43±4.56)歲,平均體重指數(shù)(23.96±5.13)kg/m2,平均病程(3.48±0.56)年。兩組年齡、體重指數(shù)、病程比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。所有患者均在知情的情況下參加本研究,并簽署知情同意書。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,批準(zhǔn)號(hào):HBZY2019-C19-01。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[12]制訂:①月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)或不規(guī)則子宮出血;②存在高雄激素血癥;③超聲監(jiān)測(cè)無排卵出現(xiàn),卵巢見多囊樣形態(tài),雙側(cè)卵巢內(nèi)卵泡數(shù)超過12個(gè)或卵巢體積超過10 ml。符合①項(xiàng)及②③中任何一項(xiàng),即可診斷。中醫(yī)癥候標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[13]中不孕脾虛痰濕證的診斷標(biāo)準(zhǔn):①月經(jīng)量少、稀發(fā)或閉經(jīng);②食欲不振,腹脹、腹瀉,大便黏膩;③帶下量多色白,質(zhì)黏;④體態(tài)肥胖、乏力、疲倦;⑤舌淡胖,邊有齒痕,苔白膩,脈滑。具有①項(xiàng)及②③④⑤其中兩項(xiàng),即可診斷。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合上述西醫(yī)診斷及中醫(yī)證型辨證標(biāo)準(zhǔn);年齡20～40歲;已婚,有正常性生活且未避孕,1年內(nèi)未妊娠;6個(gè)月內(nèi)無生育要求。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能不全;合并自身免疫性疾病;合并嚴(yán)重的細(xì)菌、真菌感染;對(duì)本研究藥物過敏;合并傳染病或精神類疾病;合并其他嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)疾病;入組前3個(gè)月使用糖皮質(zhì)激素或性激素類藥物。

1.2 治療方法

1.2.1 對(duì)照組:口服炔雌醇環(huán)丙孕酮片(達(dá)英-35,批號(hào)J20140114)口服,每日1次,每次1片。自月經(jīng)周期第1天開始口服,共服用21 d,后停藥7 d,再開始下一周期;無月經(jīng)周期者任意選擇一天開始口服,共服用21 d。治療3個(gè)月經(jīng)周期。

1.2.2 觀察組:在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用祛濕化痰方聯(lián)合針刺治療。祛濕化痰方組成:麩炒蒼術(shù)15 g,姜半夏、茯苓、丹參、皂角刺各12 g,黃芩、黃柏各10 g,陳皮9 g,甘草6 g。由醫(yī)院制劑室采用全自動(dòng)煎藥機(jī)水煎、濃縮至每袋300 ml,每日2次,每次1袋,每月月經(jīng)干凈開始服用。以1個(gè)月經(jīng)周期為1個(gè)療程,共治療3個(gè)療程。針刺治療具體如下:取穴以子宮、歸來、中極、關(guān)元、足三里、三陰交為主穴,配穴包括血海、脾俞、豐隆;針具采用0.25 mm×40 mm華佗牌一次性無菌針灸針,針法嚴(yán)格按照無菌操作要求,采用平補(bǔ)平瀉法,進(jìn)針至皮下一定深度,其中子宮、歸來、中極、關(guān)元穴的進(jìn)針角度與水平面呈30°,深度小于1.2 cm,用基本手法得氣,以患者能忍受為限。捻針角度為180°～360°,頻率為90～120次/min,施針后留針30 min。每周治療3次,以1個(gè)月經(jīng)周期為1個(gè)療程,共治療3個(gè)療程。

1.3 觀察指標(biāo) ①性激素水平:在月經(jīng)來潮后第3天抽取空腹靜脈血5 ml,離心取血清。采用免疫分析儀檢測(cè)卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、睪酮(Testosterone,T)水平。②卵巢體積:所有患者在治療前后,均于排卵日采用彩色多普勒超聲診斷儀經(jīng)陰道檢查卵巢體積。③中醫(yī)癥候積分:記錄患者治療前后的食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力癥狀,將病情嚴(yán)重程度分為無、輕、中、重四級(jí),對(duì)應(yīng)分?jǐn)?shù)依次為0、1、2、3分,分值越高提示病情越重。④炎癥因子水平:在月經(jīng)來潮第3天抽取空腹靜脈血5 ml,離心取血清。采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、TNF-α水平。準(zhǔn)備酶標(biāo)板,每孔分別滴加25 μl血清和標(biāo)準(zhǔn)品,37 ℃孵育15 min,再滴加100 μl酶底物,反應(yīng)20 min,加入顯色液,避光15 min,最后滴加終止液。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中,采用450 nm波長檢測(cè)溶液吸光度,計(jì)算IL-1β、IL-6、TNF-α水平。⑤血清miR-223、miR-181a水平:所有患者在治療前后,均于月經(jīng)周期第3天抽取空腹靜脈血5 ml,離心10 min,提取上層血清。采用miRNA提取分離試劑盒提取血清中miRNA,采用miRNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系,將配制好的體系放入的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃加熱1 min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性30 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s;最后72 ℃加熱5 min充分反應(yīng)。引物由上海生物工程公司合成,序列如下。miR-223正向:5’-ACTGTCGACTAAAGTCGGTGAC-3’,反向:5’-GCGTACTACAGCGTAGATG-3’;miR-181a正向:5’-GACGACTCTAGAAGTCGGTC-AG-3’,反向:5’-CAGCCCTACTGAAGGCTAC-3’;內(nèi)參采用U6基因,正向:5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’,反向:5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-223、miR-181a的表達(dá)量。⑥妊娠率:治療結(jié)束后每3個(gè)月隨訪1次,共隨訪1年,記錄患者治療后1年內(nèi)妊娠情況,計(jì)算每組妊娠率。

2 結(jié) 果

2.1 兩組治療前后性激素水平比較 見表1。治療前,兩組FSH、LH、T水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。治療后,兩組FSH、LH、T水平低于治療前,且觀察組FSH、LH、T水平低于對(duì)照組(均P<0.05)。

表1 兩組治療前后性激素水平比較

2.2 兩組治療前后卵巢體積比較 見表2。治療前,兩組患者卵巢體積相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后,兩組卵巢體積小于治療前,且觀察組卵巢體積小于對(duì)照組(均P<0.05)。

表2 兩組治療前后卵巢體積比較(cm3)

2.3 兩組治療前后中醫(yī)癥候積分比較 見表3。治療前,兩組食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力癥候積分相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。治療后,兩組患者食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力癥候積分低于治療前,且觀察組食欲不振、腹脹、便溏、神疲乏力積分低于對(duì)照組(均P<0.05)。

表3 兩組治療前后中醫(yī)癥候積分比較(分)

2.4 兩組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 見表4。治療前,兩組IL-1β、IL-6、TNF-α水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。治療后,兩組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于治療前,且觀察組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于對(duì)照組(均P<0.05)。

表4 兩組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(ng/L)

2.5 兩組治療前后miR-223、miR-181a水平比較 見表5。治療前,兩組患者miR-223、miR-181a水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。治療后,兩組miR-223水平低于治療前,miR-181a水平高于治療前(均P<0.05);且觀察組miR-223水平低于對(duì)照組,miR-181a水平高于對(duì)照組(均P<0.05)。

表5 兩組治療前后miR-223、miR-181a水平比較

2.6 血清miR-223、miR-181a與炎癥因子的相關(guān)性分析 見表6。血清miR-223水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.01),血清miR-181a水平與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表6 血清miR-223、miR-181a與炎癥因子的相關(guān)性分析

2.7 兩組患者妊娠率比較 1年后隨訪,觀察組21例妊娠,妊娠率為46.67%,對(duì)照組11例妊娠,妊娠率為24.44%。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.8 治療后未妊娠的多因素Logistic回歸分析 見表7。以治療后1年內(nèi)是否妊娠為因變量,以miR-223、miR-181a、IL-1β、IL-6、TNF-α為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,miR-223、IL-6為治療后1年內(nèi)未妊娠的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=2.184,3.180,P<0.01),miR-181a為治療后未妊娠的獨(dú)立保護(hù)因素(OR=0.268,P<0.01)。

表7 治療后未妊娠的多因素Logistic回歸分析

2.9 血清miR-223、miR-181a水平對(duì)治療后未妊娠的預(yù)測(cè)價(jià)值 見表8(圖1)。繪制血清miR-223、miR-181a水平預(yù)測(cè)治療后1年內(nèi)未妊娠的受試者ROC,并計(jì)算AUC,結(jié)果顯示,miR-223、miR-181a及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC分別為0.837、0.811、0.934,二者聯(lián)合預(yù)測(cè)優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測(cè)效能(Z=7.168、9.376,P<0.001)。

3 討 論

PCOS是導(dǎo)致女性不孕的一種常見疾病,目前認(rèn)為發(fā)病機(jī)制與機(jī)體炎癥狀態(tài)存在密切關(guān)聯(lián)[14-15]。PCOS患者血清存在細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6以及TNF-α等水平的異常表達(dá),這使得卵巢功能和性激素水平紊亂,抑制卵泡進(jìn)一步發(fā)育[16-17]。IL-6由184個(gè)氨基酸構(gòu)成,由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞生成并分泌至細(xì)胞外,進(jìn)而遏制Tyr磷酸化,降低PIP3激酶活力,激活NF-κB通路,加劇炎癥反應(yīng)[18]。IL-1β通過影響MCP-1等趨化因子,促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá),從而發(fā)揮促炎效應(yīng)[19]。目前西醫(yī)常用的藥物如克羅米芬、達(dá)英-35等無法改善機(jī)體炎癥狀態(tài),且有不良反應(yīng),影響其臨床療效[20]。

PCOS屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“不孕”范疇,中醫(yī)認(rèn)為其病因包括先天腎精不足、脾主運(yùn)化失調(diào)、肝失疏泄等,目前臨床上常見證型為脾虛痰濕證[21-22]。PCOS病機(jī)為脾主后天之本,脾臟運(yùn)化功能虛弱,則食欲不振;飲食水谷入于脾胃,轉(zhuǎn)化水谷精微不足,易致腹脹、便溏;脾虛則后天之精不能布散四肢,則四肢乏力;精微不能上承入腦,則神疲倦怠;脾虛不能轉(zhuǎn)輸水液,則痰濕內(nèi)生,濕阻下焦,累及胞宮,使其膏脂增加,同時(shí)脾虛致胞宮水谷精微減少,故而難以受孕[23-24]。因此,治療應(yīng)以益氣健脾、祛濕化痰為原則[25]。本研究所使用的祛濕化痰方由蒼術(shù)、半夏、茯苓、丹參、皂角刺、黃芩、黃柏、陳皮、甘草等藥物組成。方中蒼術(shù)燥濕健脾,半夏降逆祛痰,茯苓健脾利濕,丹參活血調(diào)經(jīng),皂角刺行氣消腫,黃芩燥濕安胎,黃柏清熱燥濕,陳皮健脾燥濕化痰,甘草健脾益氣。諸藥合用,共奏健脾祛濕化痰、調(diào)經(jīng)助孕之功效。本研究結(jié)果表明,觀察組治療后的中醫(yī)癥候積分低于對(duì)照組,提示祛濕化痰方聯(lián)合針刺能有效改善PCOS癥狀。

針刺治療PCOS能發(fā)揮調(diào)月經(jīng)、促排卵的作用[26]。本研究取穴以子宮、歸來、中極、關(guān)元、足三里、三陰交為主穴,以血海、脾俞、豐隆為配穴。其中子宮清熱利濕溫腎,歸來益氣調(diào)經(jīng),中極滋腎調(diào)經(jīng),關(guān)元補(bǔ)氣利尿,足三里健脾化痰,三陰交益氣健脾補(bǔ)腎,血海調(diào)經(jīng)統(tǒng)血,脾俞健脾化濕,豐隆化痰開竅。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),針刺可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,減少卵泡閉鎖,促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟[27]。針刺可減少血清IL-6和內(nèi)脂素含量,恢復(fù)受高雄激素影響的卵巢形態(tài)及功能[28]。鐘毅征等[29]發(fā)現(xiàn),針刺能上調(diào)卵巢組織lncRNA MEG3表達(dá),降低AKT水平,從而抑制炎癥反應(yīng),恢復(fù)性激素水平及卵巢功能。本研究結(jié)果表明,觀察組治療后FSH、LH、T、卵巢體積低于對(duì)照組。上述結(jié)果提示,祛濕化痰方聯(lián)合針刺能有效改善性激素水平,恢復(fù)子宮及卵巢生理功能。

PCOS相關(guān)的炎癥反應(yīng)由多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié),包括IL-1、IL-6和TNF-α。IL-1β是一種由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子,在促進(jìn)組胺生成和引發(fā)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)方面起到重要作用。IL-6由單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,反映了PCOS的嚴(yán)重程度。TNF-α是一種小分子蛋白質(zhì),由巨噬細(xì)胞分泌,在特異性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),治療后患者IL-1β、IL-6和TNF-α水平有所下降,而治療組的下降幅度明顯高于對(duì)照組。提示祛濕化痰方聯(lián)合針刺可能通過降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平抑制炎癥反應(yīng)。

miRNA是一種長度22 nt的小分子核酸,具有影響基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)多種生理過程的作用[30]。miR-223在機(jī)體的血液、肝臟、腸道等多種組織器官中均有表達(dá),其基因來源于X染色體,長度為22 nt,位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3’處,啟動(dòng)區(qū)域在多個(gè)物種間具有高度保守性[31]。韓超等[32]發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者外周血miR-223水平升高,且miR-223水平與血清PCT、CRP水平呈正相關(guān),miR-223能較好診斷早期膿毒癥,評(píng)估炎癥反應(yīng)程度。郭云波等[33]研究表明,老年重癥肺炎患者血清miR-223表達(dá)上升,與TNF-α水平呈正相關(guān)。miR-181a屬于保守的miRNA家族,其可通過3’非編碼區(qū)與特定基因序列結(jié)合,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能[34]。研究表明,miR-181a通過抑制PIAS1,降低IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平,從而阻斷胰腺腺泡細(xì)胞凋亡,改善胰腺炎癥狀[35]。張瑜等[36]發(fā)現(xiàn),急性胰腺炎患者血清miR-181a低表達(dá),輕、中、重癥三組患者miR-181a水平逐漸降低,且水平與IL-6呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明,miR-223與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相關(guān),miR-181a與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相關(guān),觀察組治療后的miR-223水平低于對(duì)照組,miR-181a水平高于對(duì)照組,提示祛濕化痰方聯(lián)合針刺可能是通過降低miR-223水平、升高miR-181a水平,從而抑制下游炎癥反應(yīng)。

綜上所述,祛濕化痰方聯(lián)合針刺能調(diào)節(jié)PCOS患者性激素水平,恢復(fù)子宮內(nèi)膜及卵巢功能,提高中醫(yī)癥候積分,抑制炎癥反應(yīng),降低血清miR-223水平,升高miR-181a水平,miR-223、miR-181a均是PCOS治療后1年內(nèi)未妊娠的獨(dú)立影響因素,二者對(duì)治療后未妊娠有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。