尚迪，孫冬巖，陳艷玲，蔣芷荷

0 引言

卵巢癌是全球最致命的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。由于起病初期缺乏特異性的臨床癥狀，75%以上的卵巢癌患者在診斷時已于病程晚期[2]。目前針對卵巢癌的標準治療方案是腫瘤細胞減滅術聯(lián)合以鉑類為基礎的化療，然而卵巢癌患者在接受長期化療后往往會產(chǎn)生耐藥性，使得卵巢癌在婦科惡性腫瘤中復發(fā)率較高，預后較差。隨著與癌癥耐藥相關的信號通路逐漸被發(fā)現(xiàn)，卵巢癌的綜合治療策略也取得了相應進展。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號轉導通路參與了細胞增殖、生長、凋亡等生理過程，是細胞生物學中調節(jié)基因表達的一種基本途徑[3]。哺乳動物MAPK級聯(lián)可以根據(jù)它們末端的絲/蘇氨酸激酶分為：細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2）途徑、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）途徑、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK）途徑和細胞外調節(jié)蛋白激酶5（extracellular signal-regulated kinase5, ERK5）途徑。ERK1/2途徑（即RAS-RAF-MEK-ERK級聯(lián)）的信號轉導在真核生物中高度保守，是MAPK通路中最具特征的一條經(jīng)典通路[4]。近年來，關于ERK1/2信號通路與卵巢癌的相關作用機制研究已經(jīng)取得很大進展。本文通過綜述ERK1/2信號通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用、ERK1/2與卵巢癌耐藥發(fā)生機制及ERK1/2抑制劑與卵巢癌相關的綜合治療等研究進展，以期為發(fā)現(xiàn)卵巢癌治療新方案提供理論支持。

1 ERK1/2的概述

1.1 ERK1/2的結構組成及功能表達

ERK是MAPK家族中的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，現(xiàn)已確定有五種亞型：ERK1～ERK5。ERK在結構域內(nèi)有一個與催化功能相關的雙葉折疊，其中氨基（N）末端葉含有5條β鏈（β1～β5）、一個保守的αc-螺旋和一個富含氨基酸的環(huán)。羧基（C）末端葉由6個保守片段（αD～αI）的α螺旋和4個含有大部分催化殘基的保守β短鏈（β6～β9）組成。ERK1和ERK2是由同一基因的兩個剪接體所編碼的蛋白質，兩者之間的序列同源性高達84%，并在體內(nèi)呈平行激活狀態(tài)[5]。

ERK1/2位于MAPK通路的下游末端。靜息狀態(tài)下，錨定蛋白將ERK1/2定位于細胞質中，ERK1/2被上游的MEK1/2激活后，通過調控酪氨酸和蘇氨酸的磷酸化而引起構象變化，磷酸化的ERK1/2和RAN結合蛋白7（Importin7）相結合，與錨定蛋白分離后通過核孔易位至細胞核及其他的細胞器，以磷酸化激活核底物的方式調節(jié)其下游數(shù)百種底物，從而產(chǎn)生特定的生物效應[6]。

1.2 ERK1/2信號通路的激活與失活

ERK1/2在真核生物中表達廣泛，是MAPK途徑中至關重要的一環(huán)。不同于MAPK途徑中的上游分子可以被多重底物激酶激活，ERK1/2只能被MEK激活。此外，ERK1/2是唯一能夠刺激下游多種底物的激活劑[7]。多種刺激因素（如病毒、生長因子、壓力環(huán)境、細胞炎性因子和致癌物等）都可激活ERK1/2產(chǎn)生級聯(lián)反應[3]。RAS的活化是ERK1/2通路的起始節(jié)點，細胞外信號通過三級酶聯(lián)反應傳遞至核內(nèi)，調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等生理過程。ERK1/2不僅是RAF的下游，也是RAF的負性抑制因子。ERK1/2底物被激活后可以產(chǎn)生兩種不同的效應：快速短期效應和延遲長期效應[8]?？焖俣唐谛侵讣せ畹腅RK1/2可反饋性刺激其上游因子和激酶（如MEK、RAF、SOS、RTKs等）抑制性磷酸化，從而阻止該途徑的信號傳遞，維持細胞功能的穩(wěn)定。而延遲長期效應可以簡單描述為快速發(fā)育生長因子同源蛋白2（SPRY蛋白）和雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase, DUSP）通過去磷酸化ERK1/2使MAPK途徑恢復基態(tài)。由于ERK1/2極少發(fā)生突變，針對性抑制ERK1/2的激活可能會成為克服腫瘤獲得性耐藥的一種潛在治療手段。

1.3 ERK1/2的生理功能

細胞質中的ERK參與調節(jié)細胞骨架形成、細胞分化、細胞遷移和代謝等過程，細胞核中的ERK則通過激活轉錄因子（c-FOS、c-MYC、FOXO3a等）調控基因表達[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2調控細胞功能的機制主要有：（1）活化抗細胞凋亡關鍵因子（CyclinD1、CKK2、CCK4等），推動細胞從G1期向S期轉變，促進細胞增殖；（2）抑制促細胞凋亡相關蛋白（Caspase-9、P53、Bax等）活性，促進細胞存活；（3）激活轉錄因子（AP-1、RRN3、UBF1、BRF1等），刺激RNA聚合酶Ⅰ和RNA聚合酶Ⅲ活化，誘導tRNA、蛋白質和核糖體合成，促進細胞生長[10]。越來越多的研究報道提示ERK1/2信號通路在異常細胞增殖、腫瘤發(fā)展和基因表達中起著至關重要的作用。

2 ERK1/2與卵巢癌的關系

2.1 ERK1/2信號通路與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展

ERK1/2信號通路可通過多種調控方式參與卵巢癌細胞的生理活動，影響其增殖。據(jù)TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)整合網(wǎng)絡分析顯示，約30%的卵巢癌患者攜帶ERK1/2通路異常激活信號[11]。混合譜系激酶3（mixed lineage kinase 3, MLK3）是一種直接作用于ERK1/2的MAPK通路激活劑。Harmych等[12]觀察到，在卵巢癌細胞系SKOV3和HEY1B中，外源性表達卵巢癌細胞中的MLK3可通過激活ERK1/2來增強其下游靶點基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）的活性，而抑制MLK3表達后，卵巢癌細胞中活化的ERK1/2和p38MAPK數(shù)量明顯減少，MMP-2和MMP-9活性降低，癌細胞的增殖、侵襲性和成瘤性受到顯著抑制。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是一種細胞周期調節(jié)因子，其過度表達被發(fā)現(xiàn)是包括卵巢癌在內(nèi)的多種人類原發(fā)性腫瘤的特征。一項研究結果顯示，MEK抑制劑（CI-1040）可通過阻斷ERK活化，引起卵巢癌細胞G1期阻滯以及cyclin D1表達顯著下調，從而抑制癌細胞生長并誘導其凋亡[13]。

ERK1/2信號通路還可影響卵巢癌的侵襲和遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中ERK1/2的活化可使癌細胞從靜止的多細胞上皮形態(tài)向高度運動的具有侵襲性的單細胞形態(tài)轉變[14]。另有研究報道，在卵巢癌細胞系OVCAR-3中，雙酚A（bisphenol A,BPA）可通過磷酸化激活ERKl/2，使參與癌細胞轉移的相關分子MMP-2、MMP-9及N-黏蛋白的表達水平升高，并使MMP-2和MMP-9的酶活性增強，從而促進癌細胞轉移，而OVCAR-3細胞經(jīng)ERKl/2抑制劑（PD098059）預處理之后，BPA的促癌細胞轉移作用也隨之消除[15]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)FBXO22（F-box protein 22）是調節(jié)細胞泛素化和細胞降解的關鍵調控因子。體內(nèi)實驗中，F(xiàn)BXO22在上皮性卵巢癌組織中表達顯著上調并通過ERK1/2途徑促進癌細胞生長和轉移。飛燕草素是一種天然色素，其作用于人卵巢癌細胞后，癌細胞的增殖呈劑量依賴性下降。Hazafa等[17]實驗證實，飛燕草素可通過改變ERK1/2和P38磷酸化狀態(tài)，阻斷ERK1/2通路，從而抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力。ERK1/2抑制劑（U0126）和飛燕草素聯(lián)用后，癌細胞的增殖和靶蛋白活性顯著下降。

MiRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮不同的作用。一些miRNA，如miR-585-3p過表達可產(chǎn)生抑癌作用。一項體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)miR-585-3p靶向肌動蛋白結合蛋白1（fascin actin-bundling protein 1, FSCN1）降低ERK1/2磷酸化水平，從而抑制腫瘤生長、增殖、遷移和侵襲[18]。此外，大量研究表明miR-126、miR-18a、miR-497、miR-585-3p、miR-651-3p等也可通過阻斷ERK1/2信號通路，抑制卵巢癌的發(fā)生和轉移[19-23]。而另一些miRNA則是通過激活ERK1/2發(fā)揮促癌作用，如miR-193a-3p、miR-665、miR-106b等[24-26]。ERK1/2信號通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，且其作用與癌細胞的類型及周圍環(huán)境密切相關，抑制該通路的激活可作為卵巢癌的一種潛在治療手段。

2.2 ERK1/2信號通路與卵巢癌耐藥機制

近些年針對卵巢癌分子標志物及治療靶點的研究不斷興起，選擇性抑制卵巢癌耐藥機制中的關鍵調控分子可能成為治療卵巢癌最直接有效的一種方式。有證據(jù)表明ERK1/2信號通路的過度激活與卵巢癌發(fā)生耐藥具有一定的相關性，該通路的功能獲得性突變已被報道在卵巢癌多個亞型中出現(xiàn)。Hew等[27]實驗發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路的異常激活作為高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）的獨立預后因素，可能是HGSOC抗雌激素治療耐藥的基礎。在HGSOC體外模型中，靶向ERK1/2通路的MEK抑制劑（塞魯美替尼）和雌激素受體拮抗劑（氟維司特）聯(lián)合應用能逆轉抗雌激素耐藥性，顯示出比單一治療更強的抗腫瘤作用。研究者將PD98059作用于卵巢癌順鉑耐藥細胞后發(fā)現(xiàn)，PD98059既可抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，使G0/G1期阻滯細胞增多，亦可通過抑制ERK1/2通路和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），增強卵巢癌細胞對順鉑的藥物敏感性[28]。Simpkins等[29]詳細研究了MEK1/2抑制劑和SRC抑制劑（AZD0530）聯(lián)合應用在增敏卵巢癌耐藥細胞中的作用機制。AZD0530是一種在晚期卵巢癌中經(jīng)常過表達和激活的酪氨酸激酶。實驗通過上調人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）和胰島素受體表達，從而激活ERK1/2信號通路，結果顯示卵巢癌細胞對AZD0530產(chǎn)生耐藥性。而沉默HER2和胰島素受體使ERK1/2信號通路失活，則可部分逆轉卵巢癌細胞AZD0530耐藥，這項實驗表明ERK1/2信號通路的激活在卵巢癌耐藥中具有一定的作用。

雖然靶向ERK1/2通路上游分子設計的抑制劑在臨床試驗中具有一定的治療效果，但同時也會導致卵巢癌重新產(chǎn)生耐藥，因而療效有限。其主要原因是ERK1/2通路上游的激酶抑制劑雖然可以抑制細胞質中ERK1/2的功能活性，但同時也減少了其負反饋回路，從而誘導通路上游成分的過度激活和耐藥性的產(chǎn)生。與RAS、RAF和MEK相比，ERK1/2在癌癥中的突變較為罕見。ERK1/2抑制劑不僅可以逆轉上游突變（包括RAS突變）導致MAPK途徑的異常激活，也能夠克服上游激酶抑制劑誘導的獲得性耐藥性[30]。基于此，Plotnikov等[31]設計了一種核轉錄序列衍生的肉豆蔻?；柞０冯模‥PE肽），它可以阻斷Importin7和ERK1/2之間的相互作用，從而抑制ERK1/2但不影響其誘導的細胞質突起，包括負反饋循環(huán)，這為靶向ERK1/2治療卵巢癌耐藥提供了一種新思路。越來越多的研究表明ERK1/2抑制劑可能比RAS、RAF或MEK抑制劑在克服耐藥方面表現(xiàn)出更好的治療效果。許多小分子及其衍生物含有雜環(huán)核，如：TZDs、吡唑、咪唑啉、喹烯酮、苯并噻唑等，已表現(xiàn)出ERK1/2抑制活性[32]。此外，一些ERK1/2小分子抑制劑包括GDC-0994、AZD0364、MK-8353、ASTX02等[33-36]，都在進行臨床試驗且有些已經(jīng)取得了較為滿意的實驗結果，但可用于臨床的分子種類仍然有限。

ERK1/2通路抑制劑導致耐藥性發(fā)生的另一種機制是旁路途徑的激活，如ERK5提供的潛在旁路可抑制ERK1/2負反饋信號轉導，拯救細胞增殖。此外，對ERK1/2級聯(lián)的藥理學抑制在減弱負反饋循環(huán)的同時，也將誘導一些受體酪氨酸激酶的前饋激活，由此進一步激活替代途徑（如PI3K/AKT信號通路），從而維持腫瘤細胞存活，產(chǎn)生耐藥[37]。有研究表明，同時在ERK1/2通路的兩個節(jié)點進行抑制，與抑制單一節(jié)點相比，可以降低25%的卵巢癌耐藥發(fā)生率[38]。因此，設計和開發(fā)出選擇性高且安全性強、能夠同時靶向ERK1/2和相關蛋白的抑制劑可能是增強抗癌作用和克服耐藥性的有效方法和重要策略。

3 基于ERK1/2信號通路的卵巢癌聯(lián)合療法

3.1 ERK1/2抑制劑聯(lián)合化療

雖然紫杉醇（paclitaxel, PTX）和卡鉑的標準化療方案已經(jīng)取得一定的臨床療效，但化療耐藥仍然是卵巢癌治療的主要障礙。一項早期研究表明，RAF或MEK抑制劑與標準化療藥物的結合可以顯著提高鉑類難治性癌癥的臨床療效并其延緩耐藥性[39]。Colic等[40]通過建立人子宮內(nèi)膜樣卵巢癌異種移植（patient-derived xenograft, PDX）模型發(fā)現(xiàn)，MEK抑制劑（貝美替尼）、貝伐珠單抗（bevacizumab, BEV）和紫杉醇PTX的新聯(lián)合方案與使用BEV和PTX雙重組合或單藥療法相比，在不增加毒性的情況下進一步提高了化療藥物的抗腫瘤活性。此前也有研究證實PTX可刺激ERK1/2磷酸化，使用MEK1/2抑制劑（PD98049）可通過抑制ERK1/2活性，明顯增強PTX對卵巢癌細胞增殖和G2/M期的阻滯效應，這提示阻斷ERK1/2信號通路可能是卵巢癌化療中的一種有效輔助手段[41]。另外，一些靶向癌基因的小分子抑制劑（克唑替尼、索拉非尼等）均在與順鉑聯(lián)用后顯示出增強卵巢癌化療敏感的特性[42-43]。

盡管目前MAPK抑制劑和化療藥物的聯(lián)合使用已初步顯示療效，但大多數(shù)患者在不到一年的時間內(nèi)就會對RAF和MEK抑制劑產(chǎn)生耐藥性，因而更多直接作用于ERK1/2的小分子抑制劑正逐漸被開發(fā)并表現(xiàn)出良好的治療效果。一項臨床試驗已經(jīng)證實ERK1/2抑制劑（ONC201）聯(lián)合PTX對靶向抑制MAPK通路上游節(jié)點產(chǎn)生耐藥性的卵巢癌治療有效（研究注冊編號NCT04055649）[44]。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)在人卵巢癌細胞系中，通過ERK1/2抑制劑（U0126）或通過小干擾RNA沉默抑制ERK2的活性，可使順鉑誘導的MAPK磷酸酶-1（MAPK phosphatase, MKP-1）表達下調，增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感度，導致癌細胞死亡增加。BVD-523是臨床實驗中最常用的一種新的、可逆的、ATP競爭性ERK1/2抑制劑，目前在晚期實體腫瘤的治療上取得了顯著的效果[46]。Myers篩選合成的ERK1/2小分子抑制劑也能有效縮小小鼠模型中人卵巢癌細胞異種移植腫瘤的體積[47]。此外，木蘭脂素是從木蘭屬物種中提取的一項天然活性成分，Song等[48]認為木蘭脂素通過抑制ERK1/2激活使卵巢癌順鉑耐藥細胞株停滯于G1期，從而發(fā)揮抗癌作用。高三尖杉酯堿、曲普瑞林等都被證實其具有抑制ERK1/2的有效成分，能夠逆轉卵巢癌順鉑耐藥[49-50]。這些結果表明，ERK1/2抑制劑可能具有未開發(fā)的卵巢癌治療潛力，之后的臨床研究似乎應該考慮將更具有針對性的ERK1/2抑制劑聯(lián)合卵巢癌標準化療方案作為一種普遍的治療選擇。

3.2 ERK1/2抑制劑聯(lián)合免疫治療

隨著免疫調節(jié)分子在婦科腫瘤領域的研究不斷開展，免疫治療逐漸成為近年來提出的卵巢癌治療新思路，如：免疫刺激細胞因子、腫瘤抗原疫苗和單克隆抗體類免疫檢查點抑制劑等[51]。針對卵巢癌的免疫治療主要是采用基于程序性死亡蛋白-1（programmed death-1, PD-1）/程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1, PD-L1）通路的免疫檢查點抑制劑，通過阻斷抑制性免疫檢查點與配體結合，增加腫瘤內(nèi)CD8+T細胞數(shù)量及活性而增強抗腫瘤效果[52]。由于卵巢癌復雜的免疫環(huán)境，目前單獨應用PD-1/PD-L1抑制劑治療晚期/復發(fā)性卵巢癌的臨床試驗尚處于Ⅰ、Ⅱ期，研究表明其客觀緩解率為5.9%～22%[53]。

研究表明，27%～36%的化療耐藥性卵巢癌會發(fā)生KRAS和BRAF突變，從而激活下游ERK激酶，增加腫瘤細胞增殖活性[54]。通常在侵襲性癌癥中使用激酶抑制劑的靶向治療可產(chǎn)生高應答率，然而由于全身細胞毒性反應、低生物利用度和肝臟代謝效應，單一使用MAPK抑制劑（如C1-1040、PD0325901和AZD6244）對卵巢癌的臨床試驗療效并不令人滿意[55-57]。一項卵巢癌腫瘤樣本的病理檢查結果顯示，腫瘤細胞中過表達的Bcl-2和P53可交替激活ERK-MAPK和PI3K通路，增強其侵襲性及耐藥性，導致不良預后[58]。另有研究發(fā)現(xiàn)通過抑制ERK-MAPK信號通路可激活T/B細胞、白細胞介素信號通路和由趨化因子和細胞因子介導的炎性反應逆轉免疫抑制腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME），產(chǎn)生免疫調節(jié)作用[59]。一項動物實驗表明，聯(lián)合使用BRAF/MEK抑制劑（達拉非尼/曲美替尼）和基于PD-1阻斷的免疫療法可增加CD8（+）腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）、CD4（+）T細胞和腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages,TAMs），產(chǎn)生較強的抗腫瘤活性[60]。

鑒于此，聯(lián)合應用靶向多個致癌信號通路的抑制劑和免疫檢查點抑制劑，將會是最大限度提高卵巢癌治療效益的一項新策略。Ramesh及其團隊[61]合成了一種雙抑制劑負載的超分子納米療法（dual inhibitors-loaded supramolecular nanotherapeutic, DiLN），它可以同時裝載兩種分別靶向ERK-MAPK和PI3K信號通路的激酶抑制劑并將其遞送至腫瘤細胞。體外實驗研究結果顯示，在卵巢透明細胞癌（TOV21G）耐藥細胞中，DiLN與PD-L1免疫檢查點抑制劑的協(xié)同組合，可介導T細胞激活免疫效應，在降低全身細胞毒性反應的同時，提高了活性藥物成分的生物利用度。相比單一使用MAPK抑制劑或免疫檢查點抑制劑來說，雙激酶抑制劑和免疫治療的聯(lián)合應用可以有效地將靶向治療的高反應率與免疫治療的長期持久性相結合，具有更好的抗腫瘤效果和延長生存能力。對于靶向ERK-MAPK信號通路與PD-1/PD-L1抑制劑的藥物組合尚無大規(guī)模的臨床試驗，這種聯(lián)合用藥在卵巢癌治療中的具體方案設計及運用效果有待進一步挖掘。

4 結語

全球卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，如何在確診時給出更好的治療方案和提供更有效的二線輔助治療，最大限度延長卵巢癌患者的生存期成為目前亟待解決的難題。近年來，針對ERK1/2通路與卵巢癌發(fā)病機制及耐藥性的相關研究越來越多。相信隨著分子生物學、生物信息學、生物實驗技術等學科的進步與發(fā)展，使用ERK1/2抑制劑的特異性治療策略會更加明確，這將為卵巢癌的治療開辟新的方向，也將為晚期卵巢癌患者的不良預后帶來極大的改善。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。