黃湘平，吳玲，譚超超

0 引言

胰腺癌是一種消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，因其具有早期癥狀隱匿、惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)，患者的五年生存率不到8%[1]。胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal carcinoma, PDAC）是最常見的胰腺腫瘤類型，占所有惡性胰腺腫瘤的80%～85%[2]，該類患者生存率較低，確診晚，手術(shù)切除后預(yù)后效果不甚理想，腫瘤易復(fù)發(fā)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一[3]，因此，早期發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)于改善患者預(yù)后、提高患者生存率具有重大的意義。

目前臨床診斷PDAC主要通過影像學(xué)和傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物檢查，影像學(xué)檢查在PDAC的早期階段敏感度和特異性較低[4]。代謝組學(xué)（metabolomics）是通過對(duì)參與疾病代謝的小分子物質(zhì)進(jìn)行研究，其價(jià)值從傳統(tǒng)的尋找疾病診斷和預(yù)測的生物標(biāo)志物到進(jìn)一步進(jìn)展為尋找異常的代謝通路，它能夠?qū)ο鄬?duì)分子質(zhì)量<1 000的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行全面測量，是了解生理和病理反應(yīng)中已知的代謝途徑和生物功能改變的一種有效方法[5]。本研究擬采用代謝組學(xué)篩選出胰腺導(dǎo)管腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移差異代謝物，尋找異常代謝通路，探索胰腺導(dǎo)管腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物，為胰腺導(dǎo)管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期診斷、治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器

甲醇（賽默飛世爾科技中國有限公司）；乙腈（賽默飛世爾科技中國有限公司）；蒸餾水（屈臣氏集團(tuán)）；EP管（湖州中銳精密科技有限公司）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo scientific公司）；液相質(zhì)譜分析儀（美國Bruker公司）；G-560E型漩渦振動(dòng)器（美國ThermoScientific公司）；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；-80℃超低溫冰箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 研究對(duì)象

本試驗(yàn)采用前瞻性隊(duì)列研究，收集湖南省人民醫(yī)院2020年8月—2021年3月住院期間確診為胰腺導(dǎo)管腺癌的血清標(biāo)本40例，以及健康對(duì)照組血清標(biāo)本31例。本研究經(jīng)湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：{2022-}-21）。

胰腺導(dǎo)管腺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后組織經(jīng)病理確診為PDAC；（2）無代謝性和免疫性疾?。ㄈ缣悄虿?、高血壓、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾?。?；（3）既往無其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有過術(shù)前放化療史；（2）病例資料缺失嚴(yán)重者；健康對(duì)照組：肝、腎、電解質(zhì)、血糖、血脂等體檢檢測結(jié)果正常，無明顯疾病、無胰腺相關(guān)疾病病史、無胰腺相關(guān)疾病家族史的健康成年人。胰腺導(dǎo)管腺癌患者是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均經(jīng)術(shù)后淋巴結(jié)組織病理結(jié)果證實(shí)。

1.3 標(biāo)本采集與處理

1.3.1 標(biāo)本采集 收集患者術(shù)后24 h之內(nèi)采集的靜脈血3～4 ml，離心取血清，術(shù)后經(jīng)病理檢測證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌（均為4℃冰箱保存不超過7天的血清樣本）。

1.3.2 標(biāo)本處理 吸取100 μl血清樣本，加入10 μl內(nèi)標(biāo)（0.3 mg/ml的L-2-氯苯丙氨酸，甲醇配置），渦旋振蕩10 s；加入300 μl蛋白沉淀劑即甲醇-乙腈（2:1,v/v），渦旋振蕩1 min；在冰水浴中超聲提取10～15 min；-20℃冰箱中靜置30 min；4℃ 13 000 r/min離心15 min，取200 μl的上清液，作LC-MS分析。

1.3.3 質(zhì)控的制備 QC用于評(píng)價(jià)進(jìn)樣前的儀器、色譜質(zhì)譜系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性，確保得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠；所有樣品各吸取10 μl于EP管中，渦旋混勻10 s，分裝成每管100 μl，共6管，其余步驟按照1.3.2標(biāo)本處理的方法進(jìn)行處理。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析

以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry, LC-MS）作為代謝物分離檢測平臺(tái)，研究胰腺導(dǎo)管腺癌患者與健康對(duì)照組血清的代謝差異，在質(zhì)譜正、負(fù)離子模式下收集數(shù)據(jù)；液相色譜條件：AcclainmTMRSLC120-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm）， 柱溫保持在40℃，進(jìn)樣量3 μl。流動(dòng)相A0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸/水（含2 mmol/L甲酸銨），流動(dòng)相B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈/水，梯度設(shè)置：2%B持續(xù)0～2 min，50%B持續(xù)2～12 min，90%B持續(xù)10～30 min，98%B繼續(xù)持續(xù)作用30～60 min；流速維持在400 μl/min；質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（electrospray ion source, ESI±），采用正負(fù)離子模式檢測，使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，流速為1.2 L/min，質(zhì)量掃描范圍20～1 000 m/z，干燥氣溫度200℃。

1.5 質(zhì)控驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)儀器的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的6份QC樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果提示6份QC樣本的偏差均在2SD范圍內(nèi)，說明儀器的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性均較好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠且能反映不同組別之間代謝組學(xué)上的差異。

1.6 數(shù)據(jù)預(yù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過Metaboscape 3.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、除噪、標(biāo)準(zhǔn)化、導(dǎo)出等預(yù)處理，再將數(shù)據(jù)上傳至HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，最后得到代謝物的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰值等信息。

將預(yù)處理得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行分析，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，使分析的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正態(tài)分布，以排除個(gè)體間差異和外界多重因素的影響，使各代謝物之間在數(shù)值上具有一定可比性；通過單變量分析，采用火山圖（Volcano Plot）顯示兩組樣本的差異性代謝物，通過t檢驗(yàn)即P<0.05和差異性倍數(shù)（FC）>1.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異性代謝物；通過主成分分析（principal component analysis, PCA）來對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行概述和離群值檢測；然后構(gòu)建偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA）模型來進(jìn)行分類，并通過K折交互驗(yàn)證和100次置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，了解模型的可靠性；通過PLS-DA得到的變量權(quán)重值（variable important in projection,VIP），以VIP>1.0篩選潛在的差異性代謝物；通過聚類分析評(píng)價(jià)不同代謝物的相關(guān)性及聚類程度；最終將得到的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床資料見表1，其中40例胰腺導(dǎo)管腺癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組臨床資料比較(n(%))Table 1 Comparison of clinical information between lymph node metastasis and non- metastasis groups of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (n(%))

2.2 單變量分析

采用單變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法篩選健康對(duì)照組和PDAC患者中血清潛在差異性代謝物，在正、負(fù)離子模式下，分別篩選出123和37種差異代謝物；PDAC患者中有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在差異性代謝物，各自篩選出4種差異代謝物，見圖1。

圖1 PDAC組與健康對(duì)照組(A, B)及PDAC組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移組(C, D)在正負(fù)離子模式下的差異代謝物火山圖Figure 1 Volcano plots of differential metabolites in PDAC and healthy control groups(A, B), lymph node metastasis and non-metastasis groups(C, D) under positive and negative ions

2.3 多變量統(tǒng)計(jì)分析

利用主成分分析方法對(duì)健康體檢組和PDAC患者血清樣本的代謝物輪廓進(jìn)行分析。在正、負(fù)離子模式下，健康體檢組和PDAC患者血清樣本的組內(nèi)代謝物差異比較小，且組間差異較顯著，兩組間的代謝輪廓存在明顯差異；利用PLS-DA方法對(duì)兩組之間的血清標(biāo)本代謝物輪廓進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，正、負(fù)離子模式下，二者之間的代謝組學(xué)的組間存在顯著差異，見圖2。

圖2 胰腺導(dǎo)管腺癌與健康體檢組多變量統(tǒng)計(jì)分析散點(diǎn)圖Figure 2 Scatterplot of multivariate statistical analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma and healthy control groups

對(duì)構(gòu)建好的模型進(jìn)行驗(yàn)證以評(píng)價(jià)模型的可靠性，以R2評(píng)價(jià)模型的解釋度，Q2評(píng)價(jià)模型的預(yù)測值，在正負(fù)離子下，R2、Q2均>0.5，說明模型擬合效果好，再對(duì)模型進(jìn)行100次置換檢驗(yàn)，得到P值，P值均<0.1，提示不存在過擬合的情況。

在成功構(gòu)建了正、負(fù)離子下健康體檢組與PDAC患者的血清標(biāo)本模型下，進(jìn)一步根據(jù)VIP值來篩選潛在的差異性代謝物，在正、負(fù)離子模式下，分別篩選出差異代謝物92和46種。同樣條件下，在正、負(fù)離子模式下，分別篩選出PDAC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間的差異代謝物12和8種。

對(duì)健康對(duì)照組和PDAC組、PDAC患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，從而更加直觀體現(xiàn)出血清差異代謝物的聚類程度。在正、負(fù)離子模式下，健康對(duì)照組和PDAC患者血清代謝物均呈現(xiàn)出較為明顯的聚類，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組聚類效果較好。

2.4 差異代謝物以及代謝通路分析結(jié)果

最終，在成功構(gòu)建了正、負(fù)離子模型下，以FC>1.5、P<0.05且VIP>1.0進(jìn)行篩選。

2.4.1 健康對(duì)照組與PDAC患者血清代謝物分析結(jié)果 在正離子模式下篩選出47種差異代謝物，其中升高的有30種：3-氨基-2-惡唑烷酮、L-苯丙氨酸、乙丙嗪、3-磷酸甘油、對(duì)稱二甲基精氨酸、單硝酸異山梨酯、3-羥基馬尿酸、2-吡咯烷酮、4-羥脯氨酸、苯基丙酮酸、L-辛?；鈮A、L-酪氨酸、蘋果酸、硫酸吲哚酚、氫化可的酯、尿囊素、槲皮素3_-硫酸鹽、D-α-氨基丁酸、L-精氨酸、4-羥基甲苯磺丁脲、磷酰膽堿、4-三甲基氨基丁酸、苯乙酸、乙基葡糖苷酸、2-丙基-2,4-戊二烯酸、半乳糖醇、3-_3-羥基苯基_-2-甲基乳酸、根皮素、鞘氨醇、2,3-丁二醇；降低的有17種：戊糖苷、前列腺素B2、加拉敏三硫醚、脯氨酸甜菜堿、丙烯酰肉堿、γ-亞麻酸、四氫脫氧皮質(zhì)酮、3-羥基丁酸、α-酮異戊酸、蛋氨酸亞砜、L-脯氨酸、十一烷二酸、氧烯洛爾、維生素A、丙酮、黃嘌呤酸、3-甲基組氨酸。

在負(fù)離子模式下最終得出29種差異代謝物：升高的有10種：8-羥基韋拉平葡萄糖醛酸、丙酮酸、11-氧代雄酮葡萄糖醛酸苷、苯丙氨酸、4-乙基苯基硫酸鹽、11-脫氫皮質(zhì)酮、前列腺素B2、降草酸、苯甲酸芐酯、雌酮；降低的有19種：2-羥基地昔帕明葡糖苷酸、硫酸雄酮、4-乙烯基苯酚硫酸鹽、丙氨酸、瓦拉尼酸、根皮素2_-O-葡糖苷酸、十五烷酸、3-硝基酪氨酸、L-組氨酸、rac-5,6-環(huán)氧-視黃酰-β-D-葡糖苷酸、2-苯基-1,3-丙二醇單氨基甲酸酯、羥基去甲基多塞平葡萄糖醛酸、5-十四碳烯酸、呋喃西林、索萊羅、6-硫尿酸、二氫黃豆苷元7-O-葡糖苷酸、二氫速甾醇、25-羥基維生素D2。

利用MetaboAnalyst 5.0對(duì)在正、負(fù)離子模式下篩選出的顯著差異性代謝物進(jìn)行代謝通路分析。依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，匹配到了26條代謝通路，再以-log(p)>0.5且Pathway impact值>0.05篩選出11條代謝通路，見表2；從圖3可以觀察到兩組之間差異代謝物濃度相差較大，重復(fù)性較好。

圖3 PDAC患者與健康對(duì)照組之間排前五的差異代謝物Figure 3 The top five differential metabolites between PDAC and healthy control groups

2.4.2 PDAC患者有無淋巴轉(zhuǎn)移兩組之間血清代謝物分析結(jié)果 在正離子模式下篩選出3種差異代謝物，其中升高的有乙丙嗪（Ethopropazine），降低的有四氫脫氧皮質(zhì)酮（Tetrahydrodeoxycorticoste rone）、氧烯洛爾（Oxprenolol）；在負(fù)離子模式下篩選出1種差異代謝物，其中升高的是苯丙氨酸（Phenylalanine）。幾種差異代謝物的ROC曲線見圖4、表3，顯示兩組之間差異代謝物濃度相差較大，重復(fù)性較好。

表3 胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異代謝物的ROC診斷效能比較Table 3 Comparison of ROC diagnostic efficacy of differential metabolites for lymph node metastasis in pancreatic cancer

3 討論

本研究基于LC-MS平臺(tái)對(duì)40例胰腺導(dǎo)管腺癌患者以及31例健康體檢組的血清學(xué)代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了76種差異代謝物和11條相關(guān)的差異代謝通路。其中戊糖苷、丙烯酰肉堿、前列腺素B2、苯乙酸、L-苯丙氨酸為排前五的血清差異代謝物，影響較大的兩條代謝通路為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和苯丙氨酸代謝，兩條差異代謝通路均匹配到了苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸三種差異代謝物。

van Dijk等[6]研究表明胰腺癌患者基礎(chǔ)蛋白周轉(zhuǎn)率明顯高于健康體檢組，從而在胰腺癌患者中會(huì)出現(xiàn)高水平的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，這與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果L-苯丙氨酸在PDAC患者中水平升高相符合，癌細(xì)胞可能通過體內(nèi)高水平的蛋白合成與分解，促進(jìn)癌細(xì)胞的大量增殖從而加強(qiáng)其對(duì)淋巴和器官的侵潤能力。黏蛋白1（MUC1）是一種異常糖基化的膜結(jié)合糖蛋白，在大于80%的PDAC病例中過度表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)，MUC1通過其胞質(zhì)尾（MUC1-CT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并與其他致癌信號(hào)分子相互作用，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移；Grover等[7]研究表明MUC1-CT中的酪氨酸突變?yōu)楸彼崮軌蛞种妻D(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化，本研究中出現(xiàn)血清酪氨酸水平的升高和丙氨酸的降低，胰腺細(xì)胞是否也可通過此種突變從而誘導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)化尚需進(jìn)一步的研究。

本研究中，丙酮酸在胰腺癌患者中處于高表達(dá)，并參與了4條差異代謝通路，糖酵解/糖代謝在胰腺癌細(xì)胞的生長中發(fā)揮重要的作用。腫瘤細(xì)胞能夠在氧氣充足的情況下，在相關(guān)催化酶的催化作用下消耗大量葡萄糖產(chǎn)生乳酸，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[8]。研究表明[9]，丙酮酸激酶M2（PKM2）在胰腺癌組織中過表達(dá)，這可能是Warburg效應(yīng)發(fā)生的機(jī)制之一，同時(shí)糖酵解中高表達(dá)的關(guān)鍵酶如PKM2和乳酸脫氫酶A（LDHA）與胰腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[10]，這兩種酶活性在胰腺癌患者的表達(dá)增加，導(dǎo)致患者血清代謝物丙酮酸水平升高。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者LDHA的過度表達(dá)導(dǎo)致其丙酮酸和乳酸的水平異常，其中4種相關(guān)代謝物（葡萄糖、乳酸、丙酮酸和檸檬酸）能夠作為胰腺癌的早期診斷和療效監(jiān)測的生物標(biāo)志物。

在此基礎(chǔ)上，本研究通過進(jìn)一步對(duì)40例胰腺癌患者淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的血清代謝組學(xué)分析，得出了四種在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中存在差異的代謝物，其中在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中升高的有：乙丙嗪、苯丙氨酸；降低的有：四氫脫氧皮質(zhì)酮、氧烯洛爾。四種差異代謝物的AUC值分別為：0.798、0.780、0.753、0.742，可見四種差異代謝物對(duì)于區(qū)分患者淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有較好的區(qū)分。苯丙氨酸的代謝能夠抑制T細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)，苯丙氨酸被IL-4誘導(dǎo)基因1（IL4I1）編碼的苯丙氨酸氧化酶氧化脫氨基，導(dǎo)致其減少和過氧化氫（H2O2）增加，進(jìn)一步導(dǎo)致T細(xì)胞增殖抑制，而T細(xì)胞是機(jī)體清除癌細(xì)胞和其他異常細(xì)胞的關(guān)鍵，因此，癌細(xì)胞可通過大量合成苯丙氨酸，從而逃脫T細(xì)胞的清除[12]。同時(shí)，苯丙氨酸作為一種在原發(fā)性腫瘤中高度存在的保護(hù)性氨基酸，能夠加強(qiáng)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移的能力[13]，而在本研究中，苯丙氨酸在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中水平明顯升高，因此，苯丙氨酸可以作為二者之間一種較好的潛在標(biāo)志物。有研究表明[14]乙丙嗪能夠促進(jìn)小細(xì)胞肺癌中癌細(xì)胞的增殖，其可能的機(jī)制為乙丙嗪通過促進(jìn)膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體CTL1對(duì)乙酰膽堿的合成作用，從而為癌細(xì)胞的大量增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而在本研究中，乙丙嗪在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的水平高于未轉(zhuǎn)移組，其具體的作用機(jī)制尚未明確，是否有可能通過這一機(jī)制導(dǎo)致癌細(xì)胞出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移需待進(jìn)一步的研究；在本研究中，四氫脫氧皮質(zhì)酮在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組處于低水平，代謝重編程為癌細(xì)胞的特性之一，各種因子，如信號(hào)蛋白（S）、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子（TFs），通過加強(qiáng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及代謝酶相互作用，在改變癌細(xì)胞的代謝狀態(tài)中發(fā)揮重要作用；有研究發(fā)現(xiàn)[15]子宮頸癌代謝物（L-賴氨酸和四氫脫氧皮質(zhì)酮）可在多種信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)代謝酶的作用下改變代謝物的狀態(tài)，這些信號(hào)蛋白是否可在PDAC患者中通過改變癌細(xì)胞的代謝狀態(tài)，從而加強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移尚需證實(shí)。

關(guān)于PDAC的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后相關(guān)的機(jī)制，尚需進(jìn)一步的研究，后續(xù)有望通過補(bǔ)充患者的胰腺癌組織標(biāo)本，對(duì)PDAC患者的代謝組學(xué)進(jìn)行更深一步的研究，尋找到更加有意義的生物標(biāo)志物，為PDAC的治療提供新靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。