阮建橋，王 晶，徐 輝，曹相玫

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

膠質(zhì)瘤是一種異質(zhì)性疾病，在成人惡性原發(fā)性腦腫瘤中常見(jiàn)，占比為70%，由于具有極強(qiáng)的侵襲性，故預(yù)后不佳[1]。根據(jù)腫瘤的侵襲性生物學(xué)行為以及不良預(yù)后將其分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，可以為膠質(zhì)瘤的治療方案提供指導(dǎo)[2]。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH） 是參與許多重要代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，包括IDH-1、IDH-2、IDH-3亞型，其中IDH-1 突變導(dǎo)致α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）轉(zhuǎn)化為2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG），其作為癌代謝物是膠質(zhì)瘤發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[3]。在膠質(zhì)瘤中，絕大多數(shù)IDH-1 突變導(dǎo)致組氨酸替代精氨酸（IDH-1 R132H），IDH-1 突變先于其他分子改變，是膠質(zhì)瘤發(fā)病的早期表現(xiàn)，也是成人膠質(zhì)瘤的重要鑒別因素，具有預(yù)后價(jià)值和作為藥物靶點(diǎn)的潛力[4-5]?，F(xiàn)階段關(guān)于IDH-1 突變對(duì)膠質(zhì)瘤的遷移及侵襲尚不明確。血管生成與膠質(zhì)瘤快速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關(guān)。本研究檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中血管生成因子與IDH-1 之間的關(guān)系，同時(shí)利用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)突變型IDH-1 的人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞，觀察其遷移能力，探討其可能機(jī)制，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

收集2020—2023 年寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科膠質(zhì)瘤病例198 例，男性112 例，女性86例；年齡≤20 歲者14 例，＞20～≤40 歲者50 例，＞40～≤60 歲者97 例，＞60 歲者37 例。腫瘤分級(jí)：Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤8 例，Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤56 例，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤39 例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤95 例。腫瘤部位：額葉22 例，顳葉39 例，其他部位137 例。實(shí)驗(yàn)使用強(qiáng)力霉素（doxycycline）誘導(dǎo)表達(dá)mutIDH-1（含IDH-1 R132H）的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87 細(xì)胞）由空軍軍醫(yī)大學(xué)葉菁教授饋贈(zèng)，生長(zhǎng)方式為貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為含1%雙抗、10%血清的最低必需培養(yǎng)基（MEM）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

doxycycline 誘導(dǎo)表達(dá)體系：1） 含IDH -1 R132H 的慢病毒表達(dá)載體為Plvx -IDH -1（R132H）；2）Tet -On 慢病毒表達(dá)載體為Plvx -Tet-On；3）doxycycline 誘導(dǎo)劑量為10 μg·μL-1。MEM 購(gòu)于上海帝博思生物科技有限公司，LumiBest 卓越型電化學(xué)發(fā)光液（SB-WB011）購(gòu)自上海圣爾生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司，全蛋白提取試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，IDH-1 一抗試劑（均為鼠單抗）、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、CD34、Ki-67，通用型二抗、EDTA （pH 9.0） 修復(fù)液、DAB 顯色液、PBS均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；VEGFR-2 抗試劑（兔單抗）購(gòu)于Bioworld Technology公司；抗體稀釋液購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司；蘇木素購(gòu)自北京九州柏林生物科技有限公司；PAS 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）

膠質(zhì)瘤組織常規(guī)石蠟切片3～4 μm，65 ℃烤片過(guò)夜，切片脫蠟至水，EDTA（pH 9.0）高壓修復(fù)3 min，自然冷卻，3% H2O2水溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶8 min，PBS 溶液沖洗，加入一抗IDH-1、GFAP、Ki-67、VEGF（稀釋比例1∶400）、VEGFR-2（稀釋比例1∶250）、CD34（稀釋比例1∶200），37 ℃恒溫箱孵育70 min，PBS 溶液沖洗，加入二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS 溶液沖洗，DAB 顯色10 min，流水沖洗阻斷顯色，蘇木素滴染1 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，水洗，淡氨水返藍(lán)數(shù)秒，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 PAS、CD34 雙重染色

CD34 進(jìn)行1.3 中的IHC 檢測(cè)步驟至DAB顯色，水洗，加入過(guò)碘酸氧化5～10 min；流水沖洗5～10 min；滴加雪夫試劑10～15 min；流水沖洗10～15 min；蘇木素復(fù)染1 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，脫色中性樹(shù)膠封片。

1.5 膠質(zhì)瘤組織IHC 及特殊染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1）IDH-1、VEGF、VEGFR-2 在細(xì)胞質(zhì)有棕黃色產(chǎn)物形成時(shí)判讀為陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)無(wú)顯色則為陰性；CD34、GFAP 在細(xì)胞膜有棕黃色產(chǎn)物時(shí)判讀為陽(yáng)性，細(xì)胞膜無(wú)顯色則為陰性，均采用半定量法進(jìn)行判讀。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡（×400）視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞100 個(gè)，首先計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%為2 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為4 分。同時(shí)評(píng)判染色深淺，無(wú)色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分，染色強(qiáng)度依據(jù)背景著色進(jìn)行對(duì)比。根據(jù)兩項(xiàng)計(jì)分相加所得總分進(jìn)行結(jié)果判定。0～2 分為陰性（-），3～4 分為弱陽(yáng)性（+或++），＞4分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[6]，陽(yáng)性率=（強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù)÷總例數(shù)）×100%。2）Ki-67 指數(shù)代表腫瘤細(xì)胞的增殖活性，指數(shù)≤10%判讀為低表達(dá)，指數(shù)＞10%判讀為高表達(dá)[7]。3）CD34 染色檢測(cè)膠質(zhì)瘤中的內(nèi)皮細(xì)胞，PAS 染色檢測(cè)腫瘤血管的基底膜。CD34 染色表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色；PAS 標(biāo)記血管基底膜，管腔基底膜呈玫紅色。高倍鏡下CD34 陰性、PAS 陽(yáng)性管道樣結(jié)構(gòu)，即為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）[8]。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及doxycycline 誘導(dǎo)

用含1%雙抗、10%血清的MEM 培養(yǎng)液進(jìn)行U87 細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞隔天換液。將培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至90%密度的膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，在直徑10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種1×106個(gè)細(xì)胞。接種8 h 后待細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分組為doxycycline 誘導(dǎo)表達(dá)組（dox+組）和非doxycycline 誘導(dǎo)表達(dá)組（dox-組），dox+組為完全培養(yǎng)基含doxycycline（10 μg·μL-1）培養(yǎng)；dox-組為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后取出至顯微鏡下觀察誘導(dǎo)效率。

1.7 Western blot 檢測(cè)U87 細(xì)胞內(nèi)IDH-1、VEGF、VEGFR-2 的表達(dá)

U87 細(xì)胞誘導(dǎo)48 h 后，收集細(xì)胞沉淀提取全蛋白。配制SDS-PAGE 凝膠，上樣等量蛋白進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)蛋白至PVDF 膜上。10%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h 后用抗體稀釋液稀釋一抗（VEGF 1∶400、VEGFR-2 1∶250）4 ℃孵育過(guò)夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色1 min 后曝光并進(jìn)行灰度測(cè)量[9]。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87 細(xì)胞遷移能力

六孔板背面畫(huà)“十”字，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)進(jìn)行3 次。過(guò)夜后細(xì)胞貼壁且密度達(dá)到80%～90%，用200 μL 槍頭在六孔板背后的“十”字進(jìn)行畫(huà)線(xiàn)。用PBS 沖洗劃起的細(xì)胞，在同一區(qū)域記錄采集0、24 和48 h 的劃痕范圍照片[10]。用Image J 軟件測(cè)量劃痕區(qū)域的面積，分析細(xì)胞的遷移速度，采用細(xì)胞劃痕愈合率比較細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞劃痕愈合率=［（0 h劃痕面積-觀察時(shí)間點(diǎn)劃痕面積）÷0 h 劃痕面積］×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用例表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法，各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IDH-1 突變膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征

膠質(zhì)瘤組織IDH-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與年齡、性別、部位及組織分級(jí)均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；Ki-67 增殖指數(shù)與患者性別及病理分級(jí)存在關(guān)聯(lián)：高表達(dá)在男性患者中表達(dá)率高（P＜0.05），低表達(dá)在女性患者中多見(jiàn)（P＜0.05），高表達(dá)在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）中表達(dá)率高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）；GFAP 在低級(jí)別膠質(zhì)瘤（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）中陽(yáng)性率為36.53%（61/167），在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）中陽(yáng)性率為63.47%（106/167），在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中陽(yáng)性率低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 膠質(zhì)瘤組織IDH-1、Ki-67 及GFAP 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.2 膠質(zhì)瘤組織HE 染色結(jié)果

經(jīng)HE 染色后確定分級(jí)，Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤8 例，Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤56 例，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤39 例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤95 例，其中以Ⅱ、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤常見(jiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤HE 染色（×200）

2.3 膠質(zhì)瘤組織中IDH-1 與Ki-67、GFAP 的關(guān)系

膠質(zhì)瘤組織IHC 結(jié)果顯示，Ki-67 高表達(dá)在突變型膠質(zhì)瘤中表達(dá)率為56.86%（58/102），野生型膠質(zhì)瘤中為57.29%（55/96）。Ki-67 高表達(dá)、低表達(dá)在突變型和野生型膠質(zhì)瘤中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GFAP 在突變型膠質(zhì)瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為92.16%（94/102），野生型中為76.04%（73/96），與野生型相比，GFAP 在突變型中高表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖2。

圖2 膠質(zhì)瘤組織IDH-1、Ki-67、GFAP 的表達(dá)（×200）

表2 膠質(zhì)瘤組織Ki-67、GFAP 表達(dá)與IDH-1 突變的關(guān)系（例）

2.4 膠質(zhì)瘤組織中CD34、VEGF 與VEGFR-2 的表達(dá)

在IDH-1 突變型中，VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率為70.59%（72/102），VEGFR-2 為73.63%（75/102），CD34 為68.63%（70/102）；在IDH-1 野生型中，VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率為54.17%（52/96），VEGFR-2為59.38%（57/96），CD34 為51.04%（49/96）；VEGF、VEGFR-2、CD34 在IDH-1 突變型中的表達(dá)均高于IDH-1 野生型（P 均＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 膠質(zhì)瘤組織中VEGF 與VEGFR-2、CD34 的表達(dá)（IHC×200）

2.5 IDH-1 突變膠質(zhì)瘤的VM

PAS-CD34 雙染膠質(zhì)瘤組織顯示，血管內(nèi)壁CD34 染色呈陽(yáng)性，基底膜呈玫紅色，為腫瘤血管成分（VM 陰性）；由膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成的不規(guī)則管腔樣結(jié)構(gòu)，CD34 染色呈陰性，基底膜不完整，PAS 呈陽(yáng)性管道樣結(jié)構(gòu)（VM 陽(yáng)性）。VM 在突變型以及野生型中均有表達(dá)，見(jiàn)圖4。

圖4 PAS-CD34 雙染檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中的VM 形成（×400）

2.6 IDH-1 突變改變U87 細(xì)胞中VEGF、VEGFR-2 蛋白的表達(dá)水平

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與dox-組相比，dox+組的VEGF、VEGFR-2 蛋白表達(dá)均增高，與IHC 結(jié)果一致（P 均＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot 檢測(cè)dox-組和dox+組U87 細(xì)胞IDH-1、VEGF、VEGFR-2 相對(duì)蛋白的表達(dá)水平

2.7 IDH-1 突變對(duì)U87 細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24、48 h 中dox+組的細(xì)胞劃痕愈合率均高于dox-組（P 均＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IDH-1 突變對(duì)U87 細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞/膠質(zhì)祖細(xì)胞發(fā)展而來(lái)[11]，最大程度手術(shù)安全切除、放療、化療、免疫療法以及相關(guān)聯(lián)合治療可以提高膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，但是膠質(zhì)瘤的極高致死率、預(yù)后效果不佳、復(fù)發(fā)率高是患者生存率極低的主要因素[12]。IDH-1 突變?cè)冖蚣?jí)、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中常見(jiàn)，90%發(fā)生在Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中，60%發(fā)生在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中，同時(shí)在繼發(fā)性膠質(zhì)瘤中也很常見(jiàn)[13]。有研究[14]報(bào)道，IDH-1 突變會(huì)導(dǎo)致2HG 堆積過(guò)多并抑制多種酶的功能以及多種依賴(lài)于α-KG 的染色質(zhì)重塑酶，從而影響腫瘤代謝循環(huán)過(guò)程。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IDH-1 突變與患者年齡、性別、發(fā)病部位、病理級(jí)別均無(wú)關(guān)聯(lián)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，dox+組的U87 細(xì)胞在24、48 h劃痕面積高于dox-組，證實(shí)IDH-1 突變使細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，從而增加腫瘤的遷移。Ki-67 是一種僅在細(xì)胞周期G1、S、G2 或M 期中期的細(xì)胞表達(dá)核心抗原，正常腦組織中幾乎不表達(dá)，Ki-67標(biāo)記指數(shù)10%是區(qū)分低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤的臨界點(diǎn)，對(duì)預(yù)測(cè)患者的生存具有重要意義[15]。本研究結(jié)果顯示，Ki-67 高表達(dá)在男性患者中表達(dá)率高，低表達(dá)在女性患者中多見(jiàn)，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）中表達(dá)率高，在突變型和野生型膠質(zhì)瘤中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與腫瘤級(jí)別越高，惡性程度越高、侵襲性越強(qiáng)一致。GFAP 是膠質(zhì)瘤標(biāo)志性的一種中間絲蛋白，幾乎只在星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤中表達(dá)，易受細(xì)胞環(huán)境的影響，與腫瘤的遷移息息相關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GFAP在突變型中高表達(dá)，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)增高，這與Priambada 等[17]關(guān)于少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和IDH-1 野生型彌漫性星形細(xì)胞瘤中GFAP 表達(dá)降低的研究結(jié)果一致，考慮GFAP 與膠質(zhì)瘤的侵襲性及預(yù)后有關(guān)。

在許多惡性腫瘤的治療方案中，抗血管治療至關(guān)重要。VEGF 是參與血管生成的重要因子，膠質(zhì)瘤細(xì)胞在缺氧情況下，VEGF 與其受體VEGFR-2 的下游信號(hào)通路被缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）激活，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，由腫瘤細(xì)胞形成不規(guī)則管狀結(jié)構(gòu)，形成新生血管[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VEGF、VEGFR-2、CD34 在突變型中高表達(dá)，同時(shí)Western blot 檢測(cè)顯示，dox+組中VEGF、VEGFR-2 表達(dá)升高，兩項(xiàng)結(jié)果提示IDH-1 發(fā)生突變，降低HIF-1α 表達(dá)水平，使VEGF 過(guò)表達(dá)，促進(jìn)新生血管生成，VEGF 過(guò)表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后不良相關(guān)[19]，因此，臨床通過(guò)抗VEGF 治療增加無(wú)進(jìn)展生存期并改善膠質(zhì)瘤患者的生活質(zhì)量。VM 在腫瘤血管形成中具有很高的可塑性，在微血管密度較低的膠質(zhì)瘤區(qū)域大量存在，完成腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的血氧供應(yīng)[20]。在雙染實(shí)驗(yàn)中，CD34 染色陰性、PAS染色陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)，即VM陽(yáng)性。VM 在突變型及野生型中均表達(dá)，證實(shí)膠質(zhì)瘤通過(guò)血管生成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲。VM 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，更易形成微血管，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞逃脫缺氧的環(huán)境及壞死區(qū)域，具有較強(qiáng)的侵襲性，導(dǎo)致患者的治療效果及預(yù)后均不佳[21]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織及細(xì)胞水平探討IDH-1 突變與膠質(zhì)瘤血管生成的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)IDH-1突變?cè)谀z質(zhì)瘤中具有至關(guān)重要的作用，一種是IDH-1 突變，2HG 大量堆積，抑制HIF-1α，誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力[22]；另一種是IDH-1 突變過(guò)表達(dá)可以減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，使發(fā)生IDH-1 突變的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后更好[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了解血管生成的機(jī)制及其抑制在膠質(zhì)瘤治療中的意義，為今后臨床膠質(zhì)瘤的抗血管治療提供新的理論依據(jù)。