徐海瑾，徐 彧，孔 斌，李 雄，李建寧，李 卉，曹婷婷，宋 輝

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌學(xué)研究所，銀川 750004；3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病機(jī)制不同，但患者都會出現(xiàn)胰島功能衰竭[1-2]。胰島移植已被證明能夠修復(fù)糖尿病患者的胰島功能，但由于異體移植免疫排斥反應(yīng)和胰島供體資源的不足而不能滿足患者的需求[3]。BMSCs 具有廣泛的增殖和分化潛能，在體外能誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞（IPCs），解決了供體胰島短缺的問題，為細(xì)胞替代治療提供了新的途徑[4]。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）在進(jìn)化上高度保守，在哺乳動物中由4 個主要成員組成，包括FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6[5]。FoxO1在肝臟和胰腺等胰島素反應(yīng)組織中高度表達(dá)，并與代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)[6]。FoxO1 基因敲除增加小鼠胰腺前體細(xì)胞來源的β 細(xì)胞數(shù)量并促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)分泌前體細(xì)胞生成IPCs[7-8]。FoxO1 促進(jìn)了人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的腸道器官樣培養(yǎng)物向功能性IPCs 的分化[9]，并上調(diào)了體外培養(yǎng)的人胎兒胰腺前體細(xì)胞生成的IPCs 中β 細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[10-11]。FoxO1 在小鼠胰腺前體細(xì)胞中的過表達(dá)會導(dǎo)致體內(nèi)胰腺發(fā)育不良[12]。此外，F(xiàn)oxO1 是成年胰島β 細(xì)胞中胰腺十二指腸同源盒因子1（pancreatic and duodenal homeobox factor1，PDX1） 的負(fù)調(diào)控因子[13]，PDX1 在胚胎期胰島β 細(xì)胞的生成和成熟過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[14]。因此，推測FoxO1 可能是BMSCs 分化為功能性IPCs 過程中的負(fù)性調(diào)控因子。本研究通過構(gòu)建干擾FoxO1 基因的shRNA 慢病毒載體，建立干擾FoxO1 的大鼠BMSCs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為后續(xù)研究FoxO1 在BMSCs 誘導(dǎo)分化為IPCs 過程中的作用及潛在機(jī)制奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步為干細(xì)胞治療糖尿病的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級4 周齡雄性SD 大鼠10 只，體質(zhì)量100～150 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，并且按照寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)定進(jìn)行操作；大腸埃希菌Stbl3 菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)oxO1 shRNA 質(zhì)粒購自湖南豐暉生物科技有限公司，引物合成、質(zhì)粒測序由生工生物工程（上海） 股份有限公司完成；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗生素溶液購自美國Gibco 公司，DMEM 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司，liopfectamineTM3000購自美國Invitrogen 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白測定試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，GAPDH 購自美國Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)oxO1 購英國Biorbyt 公司，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；總RNA 提取試劑盒、去內(nèi)毒素中提質(zhì)粒試劑盒購自美國OMEGA 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；油紅O、茜素紅購自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的原代分離及培養(yǎng) 100～150 g SPF 級雄性SD 大鼠10 只，處死后，分離股骨和脛骨，置于無菌PBS 中。75%乙醇消毒后用PBS沖洗3 遍。將股骨和脛骨兩端剪掉，用DMEM/F12 完全培養(yǎng)基多次沖洗髓腔，收集于離心管中。離心后收集沉淀，重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱。次日半量換液，后期每2 d 換1 次液，取3 代BMSCs 用于檢測和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 BMSCs 的分化功能鑒定 成骨誘導(dǎo)：待3代BMSCs 匯合度達(dá)到60%～70%時，替換為成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，間隔2 d 換液。誘導(dǎo)27 d后，茜素紅染色。成脂誘導(dǎo)：待3 代BMSCs 100%匯合，替換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A 液培養(yǎng)。3 d后，替換誘導(dǎo)分化B 液培養(yǎng)。24 h 后換回A 液繼續(xù)誘導(dǎo)。A 液和B 液交互作用，鏡下可觀察到脂滴時停止誘導(dǎo)，油紅O 染色。

1.2.3 FoxO1 干擾慢病毒載體的構(gòu)建 完成干擾和陰性對照的慢病毒載體設(shè)計(jì)（干擾質(zhì)粒組名為：sh1、sh2、sh3，空白質(zhì)粒：Vector），以嘌呤霉素抗性為穩(wěn)定篩選標(biāo)志，且質(zhì)粒攜帶EGFP 基因，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。

1.2.4 質(zhì)粒擴(kuò)增 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌受體Stbl3 中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日挑取單克隆菌落至1 mL 培養(yǎng)基內(nèi)4～6 h，獲得的菌液倒入200 mL 培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)12～16 h，結(jié)束后提取質(zhì)粒，獲取pLKO.1-EGFP+Puro 質(zhì)粒。

1.2.5 驗(yàn)證質(zhì)粒載體及篩選干擾效果最佳的質(zhì)粒 1）干擾質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T 細(xì)胞：待293T 細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時轉(zhuǎn)染。使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM 稀釋liopfectamineTM3000 和目的質(zhì)粒，稀釋后的lipo3000 和質(zhì)粒DNA 以1∶1 混勻，室溫孵育10～15 min 后，均勻滴加至六孔板內(nèi)，2 d 后熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并收集細(xì)胞。2）Western blot 檢測：提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量后，金屬浴蛋白變性5 min，經(jīng)10% SDSPAGE 分離凝膠分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。封閉液（含10%脫脂奶粉） 封閉2 h，TBST 緩沖液洗膜，一抗、二抗孵育后，再次洗膜后顯影。

1.2.6 慢病毒包裝 待293T 細(xì)胞匯合到70%～80%時包裝病毒。使用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋liopfectamineTM3000，混勻。用同種培養(yǎng)基稀釋目標(biāo)質(zhì)粒和兩個輔助質(zhì)粒，制備三質(zhì)粒DNA 預(yù)混液，混勻。將lipo3000 和三質(zhì)粒DNA 混合物1∶1混勻，室溫孵育10～15 min，加入完全培養(yǎng)基，混勻后加入六孔板中，37 ℃孵育細(xì)胞48 h，0.45 μm濾器過濾收集病毒原液，-80 ℃保存。

1.2.7 病毒滴度檢測 96 孔板每孔接種1×105個293T 細(xì)胞。在10 個無菌EP 管內(nèi)加入90 μL完全培養(yǎng)基，取病毒原液10 μL 加到第1 個EP管中，混勻，標(biāo)記為101μL，然后取101μL 管中10 μL 混合液加入第2 個管中，標(biāo)記為100 μL，依次倍比稀釋至10-8μL。將各病毒混合液依次滴加至96 孔板中。24 h 后追加10 μL 完全培養(yǎng)基，48 h 后熒光鑒定。根據(jù)綠色熒光蛋白的數(shù)量計(jì)算病毒滴度：病毒滴度=綠色熒光蛋白的數(shù)量/病毒稀釋倍數(shù)（TU·μL-1）。

1.2.8 慢病毒感染BMSCs 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果 3 代BMSCs 接種于六孔板中；次日，1 mL病毒原液+200 μL 完全培養(yǎng)基稀釋病毒后加到處理組BMSCs 中；第3 天，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；第5 天，用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，藥篩兩輪，每輪4 d，繼續(xù)培養(yǎng)后，得到干擾FoxO1 基因的BMSCs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株和對照株。收集細(xì)胞，使用Western blot 驗(yàn)證其表達(dá)效果。提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物信息

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的細(xì)胞形態(tài)

在倒置顯微鏡下可見，原代BMSCs 大小不一，呈梭形貼壁生長，分布不均，見圖1A；3 代BMSCs 呈梭形、魚排狀漩渦排列，分布較均勻，見圖1B。

圖1 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)（×40）

2.2 BMSCs 分化能力鑒定

BMSCs 通過成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)27 d 后，茜素紅染色可見大量棕色片段，即為礦鹽沉積及鈣化結(jié)節(jié)，見圖2A；通過成脂分化培養(yǎng)基培養(yǎng)26 d 后，經(jīng)油紅O 染色可觀察到細(xì)胞集落群中充滿脂滴的脂肪細(xì)胞，見圖2B。

2.3 FoxO1 干擾載體的構(gòu)建

獲得測序正確的FoxO1 干擾慢病毒載體。測序結(jié)果完全符合，無突變，表明FoxO1 干擾慢病毒載體構(gòu)建成功，見圖3。

圖3 pLKO.1-sh-FoxO1 質(zhì)粒測序峰圖

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T 細(xì)胞48 h，細(xì)胞熒光明顯，表明EGFP 表達(dá)良好，見圖4。Western blot 結(jié)果顯示，載體中標(biāo)簽蛋白表達(dá)成功，并篩選到干擾效果最佳的目的質(zhì)粒sh1-FoxO1，見圖5。

圖4 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)48 h 后的293T 細(xì)胞（×200）

圖5 Western blot 檢測293T 細(xì)胞中FoxO1 蛋白相對表達(dá)水平

2.5 FoxO1 干擾慢病毒包裝及滴度檢測

通過三因子慢病毒包裝系統(tǒng)包裝所得的慢病毒，經(jīng)過逐孔稀釋，轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h 后，熒光顯微鏡觀察293T 細(xì)胞，通過計(jì)算，慢病毒滴度為1×108TU·μL-1，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見圖6。

圖6 慢病毒滴度測定（×200）

2.6 FoxO1 慢病毒感染BMSCs 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

采用三因子慢病毒包裝系統(tǒng)包裝完成的FoxO1 慢病毒感染BMSCs，經(jīng)過最佳嘌呤霉素篩選濃度1 μg·mL-1進(jìn)行篩選，得到干擾FoxO1 基因的大鼠BMSCs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Western blot 結(jié)果顯示，與Vector 組相比，sh1 組FoxO1 的蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；RT-qPCR 結(jié)果顯示，與Vector組相比，sh1 組FoxO1 的mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.01），表明構(gòu)建的干擾表達(dá)載體在大鼠BMSCs 中有很好的表達(dá)效果，見圖7。

圖7 慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs 中FoxO1 mRNA 和蛋白檢測

3 討論

糖尿病是一種嚴(yán)重的人類代謝性疾病，主要特征為患者高血糖。目前胰島移植、胰島素注射、藥物治療等是糖尿病的主要治療手段，但其仍存在藥物依賴、異體移植免疫排斥反應(yīng)和胰島供體短缺等局限性，不能滿足臨床治療的需要[15-16]。干細(xì)胞可以分化成多種細(xì)胞系，并有可能修復(fù)、保持或提高各種組織的能力。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，將BMSCs 移植到胰腺組織后可分化為IPCs，且表達(dá)β 細(xì)胞標(biāo)志物，并在葡萄糖刺激后產(chǎn)生胰島素。將BMSCs 體外誘導(dǎo)分化的IPCs 移植到經(jīng)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體內(nèi)，可緩解其高血糖狀態(tài)[18-19]。因此，在糖尿病治療方面，將干細(xì)胞有針對性地在體外分化為IPCs，取代異常胰島β 細(xì)胞治療糖尿病已成為重要的研究方向之一[20-21]。

叉頭盒O 類蛋白（FoxO）屬于轉(zhuǎn)錄蛋白家族，參與許多細(xì)胞過程，是調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)[22]。FoxO1 的表達(dá)場所主要在胰島素敏感組織中，包括胰島β 細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。值得關(guān)注的是，F(xiàn)oxO1 在胚胎階段全部的胰腺中都有表達(dá)，但在發(fā)育成熟的胰腺中只在胰島β 細(xì)胞中表達(dá)。有研究[23]顯示，在生理代謝應(yīng)激后，去除胰島β 細(xì)胞中的FoxO1 導(dǎo)致胰島素分泌受損和β 細(xì)胞數(shù)量減少。FoxO1 基因敲除會增加小鼠胰腺前體細(xì)胞或腸內(nèi)分泌前體細(xì)胞來源的β 細(xì)胞數(shù)量[8-9]。此外，抑制FoxO1 可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[10]和人胎兒胰腺前體細(xì)胞[11-12]獲得IPCs。這些結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1 在不同時期或不同條件下的表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)對胰島β 細(xì)胞的發(fā)育、成熟和功能維持至關(guān)重要。因此，在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為IPCs 的過程中，了解FoxO1 的作用及其機(jī)制具有重要意義。

本研究構(gòu)建了FoxO1 干擾的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，選擇BMSCs 作為感染對象，并且對感染細(xì)胞進(jìn)行一定時間的嘌呤霉素的選擇后，最終獲得了穩(wěn)定低表達(dá)FoxO1 的細(xì)胞株。首先將sh1-Fox-O1、sh2-FoxO1、sh3-FoxO1 與Vector 重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，通過Western blot 篩選確定重組表達(dá)質(zhì)粒sh1-FoxO1 干擾效果最佳。然后通過三因子慢病毒包裝系統(tǒng)包裝sh1-FoxO1 慢病毒，并且確定BMSCs 的最佳嘌呤霉素篩選濃度為1 μg·mL-1。使用FoxO1 慢病毒感染BMSCs 2～3 d，嘌呤霉素篩選兩輪，每輪4 d，然后提取轉(zhuǎn)染后BMSCs 的蛋白和RNA，對FoxO1 在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性病毒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染攜帶有FoxO1 干擾慢病毒的細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1 蛋白及mRNA 表達(dá)均下調(diào)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了FoxO1 干擾BMSCs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為進(jìn)一步研究FoxO1 在誘導(dǎo)BMSCs 定向分化為IPCs 過程中的作用及其潛在機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時，通過建立起一個有效并且穩(wěn)定的誘導(dǎo)分化方案，為干細(xì)胞治療糖尿病的研究提供了有力的參考。