王治兵，趙天琪，王寶宏，董儉達(dá)，侯紹章

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004）

糖尿病是一種以血糖水平增高為特征的代謝紊亂性疾病，伴有心血管疾病、腎病、視網(wǎng)膜病、糖尿病性潰瘍等并發(fā)癥[1]。其中，糖尿病性潰瘍患者長期受高血糖的影響，導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈，常發(fā)展為足部和下肢的慢性潰瘍，更有甚者需要進(jìn)行截肢手術(shù)[2]。有研究[3]表明，血糖控制不佳、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）沉積、氧化應(yīng)激等因素均可導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面難愈。二甲雙胍是一線抗糖尿病藥物，有研究[4]發(fā)現(xiàn)，其通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。還有研究[5]表明，二甲雙胍可改善糖尿病大鼠急性創(chuàng)面延遲愈合和再上皮化障礙等問題。在高糖條件下，位于創(chuàng)面處的肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，Myo F）的AMPK 表達(dá)降低，二甲雙胍可上調(diào)高糖條件下的AMPK 表達(dá)，具體作用機(jī)制仍不清楚。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）通過促進(jìn)AMPKα 亞基Thr172 位點(diǎn)的磷酸化來增強(qiáng)AMPK 磷酸化，LKB1/AMPK 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生存、增殖、應(yīng)對營養(yǎng)和能量需求改變等方面起著核心作用[6-7]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是較為常見的炎性因子，可以直接參與組織修復(fù)。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，AMPK 可以抑制TGF-β1、血管緊張素及醛固酮誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial -mesenchymal transition，EMT）過程，但可以促進(jìn)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal epithelial transition ，MET）。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是Myo F 的重要標(biāo)志蛋白，與組織細(xì)胞的纖維化存在正相關(guān)關(guān)系[9]。因此，通過探究二甲雙胍影響糖尿病急性創(chuàng)面區(qū)成纖維細(xì)胞而改善糖尿病急性創(chuàng)面的愈合，可以為糖尿病創(chuàng)面治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 材料及儀器

健康雄性SD 大鼠18 只，體質(zhì)量為150～160 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［SPF 級，合格證編號：SCXK（N）2015-0001］。鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司），鹽酸二甲雙胍腸溶片（中國天安藥業(yè)股份有限公司），皮膚取樣器（皮膚環(huán)鉆，直徑5 mm，美國Acuderm 公司），α-SMA （中國Affinity 公司）、LKB1（中國Proteintech 公司）、TGF-β1（中國Affinity 公司），TGF-β1 抗體（中國Affinity 公司），蘇木素-伊紅試劑（中國北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型制備 將18 只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3 組，即正常血糖對照（normal control，NC）組、糖尿病對照（diabetic control，DC）組及糖尿病二甲雙胍干預(yù)（diabeitic metformin intervention，DM）組，每組6 只。室內(nèi)溫度為22～25 ℃，相對濕度為50%～60%，光照與黑暗時(shí)間各12 h，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開展實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均符合寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)。將3 組實(shí)驗(yàn)動物禁食12～24 h后，采用尾靜脈取血的方式進(jìn)行血糖檢測。其中，DM 組和DC 組分別以65 mg·kg-1劑量腹腔注射10% STZ（由pH 為4.6 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制），注射后1 周內(nèi)，每天觀察并測量實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)量、食入量、毛色及活動情況，測定每組大鼠的尾靜脈血糖，將空腹血糖＞16.7 mmol·L-1作為糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 創(chuàng)面制備 將各組大鼠常規(guī)消毒，使用王寶宏等發(fā)明的動物皮膚創(chuàng)面制備裝置（專利證書號：10032087），在每只大鼠背部脊柱兩側(cè)制備直徑為5 mm 的圓形全層皮膚創(chuàng)面，每側(cè)2 個(gè)創(chuàng)面，共4 個(gè)創(chuàng)面。無菌環(huán)境下，將二甲雙胍粉末與醫(yī)用凡士林1∶2 混合配制成二甲雙胍凡士林霜劑，于4 ℃條件下保存。制備好創(chuàng)面后，DM 組大鼠創(chuàng)面1 cm×1 cm 區(qū)域涂二甲雙胍凡士林霜劑，每天1 次，NC 組和DC 組不做處理。于實(shí)驗(yàn)第3、6、9 天分別麻醉每組2 只大鼠并收集創(chuàng)面及創(chuàng)面周圍1 cm×1 cm 區(qū)域的皮膚，每組8 個(gè)創(chuàng)面，創(chuàng)面組織沿最大直徑切開，一半創(chuàng)面固定于4%甲醛溶液中，組織經(jīng)梯度乙醇脫水、浸蠟和石蠟包埋后，連續(xù)切4 μm 厚的切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，另一半創(chuàng)面組織于-80 ℃保存。

1.2.3 Western blot 每100 mg 皮膚組織加入500 μL 裂解液，于冰上充分振蕩混勻，4 °C 冰箱中放置30 min，經(jīng)研磨儀研磨，4 °C 離心機(jī)離心后取上清，測定蛋白濃度，制成上樣緩沖液。用8% SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳（80 V/120 V）。于4 °C 條件下，300 mA 條件下轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h，TBST 清洗3次，分別加入相對應(yīng)的一抗（稀釋比例1∶1 000），4 °C 孵育過夜。次日復(fù)溫30 min，用TBST 洗膜3 次，加入二抗（稀釋比例1∶3 000），室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，使用軟件Image J 進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫組化 石蠟切片脫蠟至水，用pH 為6.0 的0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行高溫抗原修復(fù)10 min 后冷卻至室溫，0.3% H2O2孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次，山羊血清于室溫下封閉1 h，滴加一抗工作液4 °C 孵育過夜。次日復(fù)溫1 h，PBS 洗3次，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液在37 °C 溫箱孵育20 min，PBS 沖洗3 次，加入二抗工作液室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次。避光滴加DAB 顯色液，觀察有棕黃色產(chǎn)物出現(xiàn)并不再變色后終止反應(yīng)，切片由Motic 數(shù)字切片系統(tǒng)掃描，利用Image J 軟件分析陽性表達(dá)強(qiáng)度[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量及血糖

實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠體質(zhì)量和血糖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。糖尿病模型制備后，與NC組大鼠比較，DC 組和DM 組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體質(zhì)量減輕，毛色無光澤，活動度降低。與NC 組比較，DC 組和DM 組大鼠的體質(zhì)量降低，尾靜脈血糖升高（P 均＜0.05）。與DC 組比較，DM 組體質(zhì)量和血糖的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見圖1。在創(chuàng)面愈合前后，NC 組大鼠體質(zhì)量均高于DC 組與DM 組（P 均＜0.05）；NC組大鼠血糖均低于DC 組與DM 組（P 均＜0.05），見圖2。

圖1 大鼠造模前后體質(zhì)量及血糖比較

圖2 大鼠創(chuàng)面愈合前后體質(zhì)量及血糖比較

2.2 LKB1 在各組大鼠皮膚表皮中的表達(dá)

免疫組化染色和Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測LKB1 在糖尿病大鼠中的創(chuàng)面愈合結(jié)果顯示，與NC 組比較，DC 組大鼠創(chuàng)周皮膚及創(chuàng)面角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）中LKB1 表達(dá)降低（P 均＜0.05），且DC組大鼠在第3、6、9 天創(chuàng)周皮膚角質(zhì)形成中LKB1的表達(dá)變化較小；在DC 組中，創(chuàng)面KCs 中LKB1的表達(dá)量在第3 天最低，第6、9 天，DC 組大鼠創(chuàng)面KCs 中LKB1 的表達(dá)量降低（P 均＜0.05）；經(jīng)二甲雙胍治療后，糖尿病大鼠創(chuàng)周及創(chuàng)面皮膚KCs 中LKB1 的表達(dá)量增高（P 均＜0.05），見圖3～圖5。

圖3 各組大鼠創(chuàng)周組織LKB1 免疫組織化學(xué)染色

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織LKB1 免疫組織化學(xué)染色

圖5 各組大鼠皮膚組織中創(chuàng)周與創(chuàng)面的LKB1 的表達(dá)

2.3 TGF-β1 在各組大鼠皮膚Myo F 中的表達(dá)

免疫組化染色和Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1 在各組大鼠皮膚Myo F 中的表達(dá)結(jié)果顯示，在NC 組創(chuàng)面愈合過程中，創(chuàng)面愈合第3、6天，Myo F 中TGF-β1 的表達(dá)降低并低于創(chuàng)周組織；創(chuàng)面愈合第9 天，創(chuàng)面Myo F 中TGF-β1 的表達(dá)增高，其表達(dá)量接近于創(chuàng)周Myo F；與NC 組比較，DC 組大鼠創(chuàng)面及創(chuàng)周Myo F 中TGF-β1的表達(dá)增高（P＜0.05）；與DC 組比較，DM 組大鼠創(chuàng)面及創(chuàng)周Myo F 中TGF-β1 的表達(dá)均降低（P均＜0.05），見圖6、圖7、圖8。

圖6 各組大鼠創(chuàng)周組織TGF-β1 免疫組織化學(xué)染色

2.4 α-SMA 在各組大鼠皮膚Myo F 中的表達(dá)

免疫組化染色和Western blot 檢測α-SMA在各組大鼠皮膚Myo F 中的表達(dá)結(jié)果顯示，與NC 組比較，DC 組大鼠創(chuàng)周Myo F 中α-SMA 的表達(dá)增高（P＜0.05）；與DC 組比較，DM 組大鼠創(chuàng)周Myo F 中，α-SMA 的表達(dá)降低（P＜0.05）。在NC 組大鼠創(chuàng)面Myo F 中，α-SMA 的表達(dá)隨著創(chuàng)面愈合過程逐漸上調(diào)；但與NC 組比較，在第3、6、9 天，DC 組大鼠創(chuàng)面Myo F 中α-SMA 的表達(dá)量增高（P＜0.05）；與DC 組比較，DM 組大鼠創(chuàng)面Myo F 中，α-SMA 的表達(dá)量降低（P＜0.05），見圖9、圖10、圖11。

圖9 各組大鼠創(chuàng)周組織α-SMA 免疫組織化學(xué)染色

圖10 各組大鼠創(chuàng)面組織α-SMA 免疫組織化學(xué)染色

圖11 各組大鼠皮膚組織中創(chuàng)周和創(chuàng)面的α-SMA 表達(dá)

3 討論

糖尿病患者，皮膚損傷后愈合延遲是糖尿病創(chuàng)面的重要臨床特點(diǎn)。糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)愈合延遲主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激增強(qiáng)、炎癥消退延遲等[9]。糖尿病創(chuàng)面的新興治療方法主要包括自體皮膚移植、負(fù)壓吸引和光子治療等，但是其有效性和安全性一直存在爭議。

糖尿病難愈性創(chuàng)面的形成是多因素、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜病理過程。在糖尿病創(chuàng)面持續(xù)的高糖環(huán)境下導(dǎo)致AGEs 蓄積，從而導(dǎo)致糖尿病皮膚創(chuàng)面組織細(xì)胞功能紊亂[10]。創(chuàng)面愈合主要在Myo F、KCs 及炎性細(xì)胞等多種細(xì)胞以及細(xì)胞，外基質(zhì)、細(xì)胞因子等共同參與并相互調(diào)控下完成[11]。AMPK是調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶，參與多種信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白。AMPK 被激活后能夠直接調(diào)節(jié)葡萄糖的代謝。在創(chuàng)面修復(fù)的過程中，Myo F 通過增殖、分化和遷移形成新的組織結(jié)構(gòu)，參與完成創(chuàng)面愈合過程[12-13]。有研究[14]表明，AMPK 被激活后會抑制Myo F 生長及相關(guān)蛋白合成，創(chuàng)面愈合過程中，NC、DC 及DM 組大鼠的RE 區(qū)AMPKα 的表達(dá)均下調(diào)，提示AMPK 可能參與皮膚的損傷修復(fù)，AMPK 表達(dá)的下調(diào)可能會促進(jìn)Myo F增殖和相關(guān)蛋白的合成。同時(shí)，有研究[15]也顯示，Myo F 的成熟分化與AMPK 的表達(dá)上調(diào)呈正相關(guān)。

Myo F 是指含有肌動蛋白、肌球蛋白和其他肌肉蛋白的成纖維樣細(xì)胞，是由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。α-SMA 是Myo F 細(xì)胞的重要標(biāo)志蛋白，參與纖維化形成[16]。有研究[17-18]提出，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Myo F 后，具有產(chǎn)生膠原纖維的功能，促使腎間質(zhì)等發(fā)生纖維化。本研究結(jié)果顯示，在創(chuàng)面愈合過程中，NC 組創(chuàng)面組織有α-SMA 表達(dá)，這是由于創(chuàng)面修復(fù)過程中有肉芽組織形成，成纖維細(xì)胞分泌大量的膠原蛋白，并且向Myo F 轉(zhuǎn)化，后者可以表達(dá)α-SMA，實(shí)驗(yàn)第9 天時(shí)，DC 組的α-SMA 蛋白表達(dá)量高于NC 組，而DM 組的α-SMA 蛋白表達(dá)量低于DC 組。提示高糖環(huán)境促進(jìn)Myo F 標(biāo)志蛋白α-SMA 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的增加，促使組織纖維化的發(fā)生，當(dāng)二甲雙胍干預(yù)后，α-SMA 的表達(dá)降低，促進(jìn)了EMT 過程從而有利于創(chuàng)面愈合。這與Berlanga-Acosta 等[19]的研究結(jié)果一致，二甲雙胍通過減少包括α-SMA 在內(nèi)的相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制EMT 過程，從而改善了肝纖維化。也有研究[20]認(rèn)為，在高糖環(huán)境下，皮膚組織中Myo F 分泌膠原蛋白能力增加，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩。

LKB1 基因的編碼產(chǎn)物L(fēng)KB1 蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理病理過程。LKB1 促進(jìn)AMPKα 亞基上的Thr172 位點(diǎn)磷酸化來提高AMPK 的磷酸化水平，被激活后的AMPK可以部分介導(dǎo)上皮細(xì)胞緊密連接的組合和分解[21]。LKB1/AMPK 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等及應(yīng)對營養(yǎng)和能量的需求中發(fā)揮著核心作用[6-7]。有報(bào)道[22]表明，AMPK 可以調(diào)節(jié)緊密連接的形成。結(jié)合本研究及本課題組之前的實(shí)驗(yàn)，降糖藥二甲雙胍可以作為AMPK 的激活劑已被證實(shí)，DC 組大鼠RE 區(qū)LKB1 的表達(dá)低于NC 組和DM 組，AMPK 的表達(dá)也低于NC 組和DM 組，細(xì)胞間緊密連接增加，外用二甲雙胍可以上調(diào)糖尿病大鼠LKB1 和AMPK 的表達(dá)，這提示二甲雙胍對創(chuàng)面皮膚愈合過程有潛在的促進(jìn)作用。TGF-β1 是一種重要的細(xì)胞因子，與許多纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，TGF-β1 能參與細(xì)胞的生長、分化，也可以直接參與組織修復(fù)等，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞的生長[23-24]。本研究顯示，DC 組TGF-β1的表達(dá)高于NC 組，提示糖尿病大鼠上調(diào)TGFβ1 在皮膚組織的表達(dá)，且AMPKα 的表達(dá)與TGF-β1 水平均呈負(fù)相關(guān)性。與DC 組大鼠相比，DM 組大鼠TGF-β1 表達(dá)降低，這些結(jié)果表明，AMPK 抑制TGF-β1 的表達(dá)。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，AMPK可以抑制血管緊張素、醛固酮及TGF-β 誘導(dǎo)的EMT 過程，同時(shí)促進(jìn)MET 過程。TGF-β 及Smad信號通路通過介導(dǎo)足細(xì)胞損傷、EMT 及腎細(xì)胞凋亡等最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[25]，但是在皮膚組織中，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。以上結(jié)果表明，升高的AMPK 上游激酶LKB1 會抑制TGF -β1 的轉(zhuǎn)錄活性，激活A(yù)MPK 也會抑制TGF-β1 的活性，二甲雙胍上調(diào)糖尿病大鼠皮膚組織AMPK 的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1 和α-SMA 的表達(dá)，從而促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合。綜上所述，二甲雙胍可以下調(diào)糖尿病大鼠創(chuàng)面組織成纖維細(xì)胞的纖維化而促進(jìn)其愈合。