代容春 ，林榮華，何文錦，薛 婷，陳建楠，陳 菁，孫化淼

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建福州 350117）

蝦青素是一種具有超強(qiáng)抗氧化活性的類胡蘿卜素含氧衍生物，應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、功能性食品、養(yǎng)殖業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[1-2]。天然蝦青素主要是從水產(chǎn)品的加工廢棄物、細(xì)菌和真菌及藻類中獲得。水產(chǎn)品的加工廢棄物中蝦青素含量比較低，且因?yàn)樘崛∵^(guò)程較為復(fù)雜導(dǎo)致提取的成本較高，因此不宜作為大規(guī)模提取天然蝦青素的原料[3]。細(xì)菌和真菌雖然繁殖速度快、培養(yǎng)成本低，但是菌體蝦青素含量很低，并不適合作為蝦青素的制備原料[3]。綜合考慮，藻類被認(rèn)為是提取天然蝦青素最佳的原材料。其中湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris）是公認(rèn)的生產(chǎn)天然蝦青素的理想來(lái)源，是高價(jià)值的工業(yè)微藻[4-6]。湖泊紅球藻是淡水單細(xì)胞綠藻，目前主要采用兩步法誘導(dǎo)藻細(xì)胞積累蝦青素，首先，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段最大限度地獲取生物量，藻體為綠色；其次，蝦青素誘導(dǎo)階段通過(guò)逆境條件誘導(dǎo)蝦青素的大量積累，藻體逐漸轉(zhuǎn)為紅色。當(dāng)前培養(yǎng)周期長(zhǎng)、蝦青素產(chǎn)量不高及藻種退化等問(wèn)題直接影響湖泊紅球藻的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用[7-8]。因此，選育優(yōu)良的湖泊紅球藻藻株、篩選湖泊紅球藻最適宜的培養(yǎng)條件具有重要意義。

近年來(lái)，許多研究者在提高湖泊紅球藻的生長(zhǎng)性能和蝦青素產(chǎn)量方面進(jìn)行了探索并取得了一定的成果。如Khorshidi 等[9]利用靜磁場(chǎng)（SMF）促進(jìn)了湖泊紅球藻的生長(zhǎng)和蝦青素產(chǎn)量的提高。Lee 等[10]通過(guò)引入“紅細(xì)胞”接種體系（RCIS）并在培養(yǎng)基中添加FeSO4、NaCl 和NaHCO3等成分有效縮短了湖泊紅球藻的培養(yǎng)周期。Zhu 等[11]用納米氣泡水（NBW）代替培養(yǎng)基中的蒸餾水使湖泊紅球藻的生物量提高了44%。但迄今為止國(guó)內(nèi)外對(duì)湖泊紅球藻的相關(guān)研究主要集中在促進(jìn)藻株生長(zhǎng)及蝦青素積累的培養(yǎng)條件方面[9-13]，藻種改良上僅見(jiàn)LE-FEUVRE 等采用秋水仙堿對(duì)湖泊紅球藻進(jìn)行多倍體育種使蝦青素產(chǎn)量提高了33%[14]。誘變育種是一種重要的育種方法，但在湖泊紅球藻中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，利用誘變育種技術(shù)改良現(xiàn)有湖泊紅球藻藻種，選育優(yōu)良的高產(chǎn)突變?cè)逯陝?shì)在必行。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變是一種新型的誘變育種手段，具有高效、突變速度快、環(huán)境友好等特點(diǎn)[15]；與其它物理誘變方法相比，ARTP 具有放電均勻、活性粒子濃度高、操作簡(jiǎn)單、安全性好等優(yōu)點(diǎn)[16]。因此，ARTP 已廣泛應(yīng)用于微生物、微藻、植物種子等材料，并取得良好的誘變效果。如采用ARTP 誘變褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）使固氮酶活性提高了101.72%[15]，ARTP 誘變裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum）使二十二碳六烯酸（DHA）產(chǎn)量提高了46.12%[16]；小新月菱形藻（Nitzschia closteriumf.minutissima）和湛江等鞭金藻（Isochrysis zhangjiangensis）經(jīng)ARTP 誘變后藻株生長(zhǎng)速度和目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量均有明顯的提高[17-18]；ARTP 輻照還促進(jìn)了兩色金雞菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)[19]，促進(jìn)了玉米（Zea maysL.）幼苗的生長(zhǎng)[20]。本研究利用常壓室溫等離子體誘變儀對(duì)湖泊紅球藻進(jìn)行誘變，篩選生長(zhǎng)快、蝦青素產(chǎn)量高的突變?cè)逯辍ＵT變之后采用單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)，優(yōu)化湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株生長(zhǎng)的光照強(qiáng)度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件，并進(jìn)一步篩選積累蝦青素的適宜高光照條件。高產(chǎn)藻株多次繼代后，通過(guò)測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的藻細(xì)胞密度以及蝦青素誘導(dǎo)階段的蝦青素產(chǎn)量，來(lái)觀察高產(chǎn)突變?cè)逯甑谋硇秃瓦z傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)采用等離子誘變結(jié)合培養(yǎng)條件的優(yōu)化使湖泊紅球藻能更高效地增加生物量和積累蝦青素，結(jié)果對(duì)選育湖泊紅球藻產(chǎn)蝦青素工業(yè)藻株具有現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)其他藻類的育種具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris）藻種H5武漢水生所，培養(yǎng)條件：BBM 培養(yǎng)基[21]、溫度20 ℃、光照強(qiáng)度2000 lx、光暗比12 h:12 h；培養(yǎng)基各組成成分藥品 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR 體系反應(yīng)物、DNA Marker TaKaRa 公司；魯哥氏碘液 生工生物工程（上海）股份有限公司；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品、二氯甲烷 色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇 色譜級(jí)，德國(guó)默克公司。

ARTP-ⅡS 常壓室溫等離子體誘變儀 無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；5424R 高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份有限公司；lifeECO PCR 儀 Gene Company Limited；SMART 光學(xué)顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；JXFSTPRP-64 全自動(dòng)樣品快速研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LJG-12 真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；2695 高效液相色譜 沃特世科技上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種的鑒定 藻種無(wú)菌純化后擴(kuò)大培養(yǎng)，取適量藻液，8000 r/min 離心5 min 后收集藻泥，CTAB法[22]提取藻細(xì)胞DNA，利用通用引物TGF、TGR（由生工生物公司合成）擴(kuò)增18S rDNA，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，陽(yáng)性條帶切膠回收后送生工生物公司進(jìn)行基因測(cè)序。使用NCBI 對(duì)18S rDNA 基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2 等離子誘變 參考潘艷飛[22]的實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的湖泊紅球藻稀釋100 倍后取200 μL 于載玻片上，均勻涂開(kāi)，使用ARTP 誘變儀進(jìn)行誘變。照射距離2 mm，氣體流速10 L/min，輸入功率：240 W或400 W，照射時(shí)間：30、60、90、120、150、180、210 s 7 個(gè)梯度，以照射時(shí)間0 s 為對(duì)照。誘變完成后，將載玻片上的藻液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，并用200 μL 培養(yǎng)基沖洗載玻片，一并轉(zhuǎn)入離心管，黑暗靜置3 h 后取200 μL 藻液均勻涂布到固體平板上。每個(gè)處理重復(fù)3 次。固體平板培養(yǎng)條件：BBM 瓊脂培養(yǎng)基、光照強(qiáng)度2000 lx、培養(yǎng)溫度20 ℃。21 d 后統(tǒng)計(jì)不同功率、不同誘變時(shí)間下的單藻落數(shù)量，計(jì)算致死率。致死率（%）=各處理單藻落數(shù)量/對(duì)照單藻落數(shù)量×100。確定致死率為90%左右的輸入功率和照射時(shí)間，重新多次進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 高產(chǎn)藻株的篩選 突變株的初篩，待固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單藻落，將平板移至8000 lx 的高光照下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20 ℃,一定時(shí)間后挑選體積較大且顏色較紅的單藻落培養(yǎng)于24 孔板，待藻細(xì)胞繁殖較多時(shí)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

突變株的復(fù)篩，將通過(guò)初篩獲得的藻株擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行藻細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，5000 r/min 離心5 min 收集藻細(xì)胞，以1.2×105cell/mL的起始藻細(xì)胞密度進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：BBM 培養(yǎng)基、光照強(qiáng)度2000 lx、溫度20 ℃，每天搖瓶2 次，培養(yǎng)14 d 后，再次進(jìn)行藻細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：取藻液1 mL，加入魯哥氏碘液10 μL 固定藻細(xì)胞，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)5 次，取平均值。篩選生長(zhǎng)快速的藻株。將這些藻株的藻液轉(zhuǎn)移至脅迫培養(yǎng)條件（光照強(qiáng)度8000 lx）下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20 ℃，21 d 后取樣測(cè)定蝦青素含量，計(jì)算藻株的蝦青素產(chǎn)量。未經(jīng)誘變的野生型藻株作為對(duì)照，選擇生長(zhǎng)快、蝦青素產(chǎn)量高的突變株作為高產(chǎn)藻株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

蝦青素含量的測(cè)定方法：參考國(guó)標(biāo)GB/T 31520-2015 紅球藻中蝦青素的測(cè)定，采用高效液相色譜法[23]。色譜柱為Sun Fire C18 250×4.6/5 μm（18600 2560），色譜條件：檢測(cè)器為PDA，流動(dòng)相為甲醇:去離子水=95:5，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)474 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。用蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=200815x+1036（R2=0.9992），線性范圍1～20 μg/mL，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算湖泊紅球藻的蝦青素含量。

1.2.4 高產(chǎn)藻株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 高產(chǎn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段培養(yǎng)條件的優(yōu)化以藻細(xì)胞密度為指標(biāo)對(duì)影響湖泊紅球藻生長(zhǎng)的因子光照強(qiáng)度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在溫度20 ℃和BBM 培養(yǎng)基的條件下，分別以1000、1500、2000、2500、3000 lx 為光照強(qiáng)度，確定湖泊紅球藻生長(zhǎng)的適宜光照強(qiáng)度；在光照強(qiáng)度2000 lx 和BBM 培養(yǎng)基的條件下，分別以15、20、25、30、35 ℃為培養(yǎng)溫度，確定湖泊紅球藻生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)溫度；在光照強(qiáng)度2000 lx 和溫度20 ℃的條件下，分別以MCM[21]、BBM、BG11[21]、TAP[24]、HS[24]為培養(yǎng)基，確定湖泊紅球藻生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基。

采用L9（34）正交試驗(yàn)，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)計(jì)因素光照強(qiáng)度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的水平值（見(jiàn)表1），篩選湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段的最適培養(yǎng)條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of orthogonal experimental factor levels

按上述實(shí)驗(yàn)配制新鮮培養(yǎng)基于錐形瓶中，每瓶100 mL，各3 瓶。取預(yù)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同復(fù)篩實(shí)驗(yàn)）至對(duì)數(shù)期的高產(chǎn)藻株藻液，5000 r/min 離心5 min 收集藻細(xì)胞，加入培養(yǎng)基中，使藻細(xì)胞培養(yǎng)起始密度為1.2×105cell/mL，按單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)的培養(yǎng)條件進(jìn)行靜置培養(yǎng)，每天搖瓶2 次，培養(yǎng)14 d 后，再次進(jìn)行藻細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。計(jì)算湖泊紅球藻生長(zhǎng)率。生長(zhǎng)率（倍數(shù)）=[培養(yǎng)后細(xì)胞密度（cell/mL）-培養(yǎng)前細(xì)胞密度（cell/mL）]/培養(yǎng)前細(xì)胞密度（cell/mL）。

1.2.4.2 高產(chǎn)藻株蝦青素誘導(dǎo)階段光照強(qiáng)度的篩選高光照脅迫中，設(shè)置7000、8000、9000、10000、11000、12000 lx 6 個(gè)光照強(qiáng)度的梯度，觀察不同光照強(qiáng)度對(duì)湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株蝦青素積累的影響。取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段在上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件下同步培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末的藻液放置于各高光照脅迫下，培養(yǎng)溫度25 ℃，每個(gè)脅迫處理3 瓶，培養(yǎng)21 d 后取樣品進(jìn)行蝦青素含量檢測(cè)，并計(jì)算藻株的蝦青素產(chǎn)量。

1.2.5 高產(chǎn)藻株多次繼代后表型的觀察測(cè)定 高產(chǎn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段細(xì)胞密度的測(cè)定：在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下（光照強(qiáng)度2000 lx、溫度25 ℃、培養(yǎng)基BG11）多次繼代后，采用起始細(xì)胞密度1.2×105cell/mL 進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16 d后測(cè)定培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞密度。部分藻液培養(yǎng)14 d后用于蝦青素誘導(dǎo)階段的培養(yǎng)測(cè)定。

高產(chǎn)藻株蝦青素誘導(dǎo)階段蝦青素產(chǎn)量的測(cè)定：采用上述篩選后的光照條件（光照強(qiáng)度10000 lx）培養(yǎng)湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株，每3 d 取適量的藻液，8000 r/min離心10 min 后去上清，藻泥真空冷凍至完全干燥。當(dāng)湖泊紅球藻由綠色轉(zhuǎn)為紅色時(shí)結(jié)束取樣，測(cè)定樣品的蝦青素含量，計(jì)算藻株的蝦青素產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Duncan 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用標(biāo)記字母法表示。利用Excel 軟件制作柱形圖和折線圖。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 18S rDNA 序列的克隆、測(cè)序與比對(duì)

18S rDNA 序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 同源性分析，結(jié)果顯示該序列與Gen Bank 中登錄號(hào)為KY364700.1 與LC013980.1 的Haematococcus lacustris的序列相似度分別為99.89%和99.66%，確認(rèn)該藻株為湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris）。

2.2 等離子誘變條件的確定

ARTP 產(chǎn)生的等離子活性粒子可以穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成遺傳物質(zhì)損傷，引發(fā)細(xì)胞修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的快速誘變[25-26]。由圖1 可以看出，ARTP輸入功率240 W 和400 W 均會(huì)導(dǎo)致湖泊紅球藻不同程度的損傷死亡，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率不斷提高；功率240 W 誘變時(shí)間150 s 致死率為89.7%，功率400 W 誘變時(shí)間120 s 致死率為90.5%；誘變時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞全部死亡，功率240 W 誘變時(shí)間210 s 以上或功率400 W 誘變時(shí)間180 s 以上致死率均為100%。選擇90%左右的致死率作為誘變的條件，因?yàn)榇藭r(shí)，大部分細(xì)胞死亡，少部分的細(xì)胞可能通過(guò)自身修復(fù)引起細(xì)胞基因和表型的改變。因此，湖泊紅球藻等離子誘變的適宜條件是功率240 W、誘變時(shí)間150 s 或功率400 W、誘變時(shí)間120 s。后續(xù)誘變實(shí)驗(yàn)中約半數(shù)誘變處理采用功率240 W、誘變時(shí)間150 s 的條件，其余采用功率400 W、誘變時(shí)間120 s 的條件。

圖1 ARTP 輸入功率與誘變時(shí)間對(duì)湖泊紅球藻致死率的影響Fig.1 Effects of input power and mutation time of ARTP on the lethal rate of Haematococcus lacustris

2.3 高產(chǎn)藻株的篩選

2.3.1 高產(chǎn)藻株的初篩 未經(jīng)誘變的湖泊紅球藻在固體平板上于2000 lx 光照下培養(yǎng)28 d 后，藻落數(shù)量多、分布均勻、大小較為一致（圖2a）。經(jīng)過(guò)ARTP適當(dāng)誘變處理后大部分藻細(xì)胞死亡，相同條件培養(yǎng)后長(zhǎng)出的藻落數(shù)量少，但有些單藻落長(zhǎng)勢(shì)良好；繼續(xù)在8000 lx 的高光強(qiáng)下培養(yǎng)28 d，出現(xiàn)一些體積大、顏色紅的單藻落（圖2b），挑選培養(yǎng)于24 孔板，一定時(shí)間后轉(zhuǎn)移至錐形瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)初篩獲得了68 株突變?cè)逯赀M(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖2 湖泊紅球藻在固體平板上的生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of Haematococcus lacustris on solid plate

2.3.2 高產(chǎn)藻株的復(fù)篩 如圖3，經(jīng)過(guò)初篩獲得的68 株突變?cè)逯昙耙吧驮逯晖ㄟ^(guò)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段培養(yǎng)14 d 后，野生型藻細(xì)胞密度為5.1×105cell/mL，測(cè)定得到細(xì)胞密度提高10%以上的突變?cè)逯暧?1 株，將此21 株藻株按實(shí)驗(yàn)先后順序進(jìn)行編號(hào)，其中編號(hào)為HP3、HP5 和HP9 的藻細(xì)胞密度最高，均為6.4×105cell/mL，比野生型提高了25.5%。

圖3 篩選獲得的生長(zhǎng)較快的突變?cè)逯甑募?xì)胞密度Fig.3 Cell density of the mutant strains with fast growth was obtained

如圖4，野生型藻株再經(jīng)過(guò)蝦青素誘導(dǎo)階段培養(yǎng)21 d 后蝦青素產(chǎn)量為16.224 mg/L。上述經(jīng)過(guò)篩選獲得的生長(zhǎng)較快的21 株誘變?cè)逯杲?jīng)過(guò)脅迫培養(yǎng)后，測(cè)定得到蝦青素產(chǎn)量提高40%以上的有11 株，其中編號(hào)為HP2、HP3 和HP9 的3 株產(chǎn)量最高，分別為25.192、26.212、25.004 mg/L，蝦青素產(chǎn)量分別提高了55.3%、61.6%和54.1%。因此，選擇生長(zhǎng)最快、蝦青素產(chǎn)量最高的突變株HP3 作為高產(chǎn)藻株，進(jìn)行后續(xù)藻株培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

圖4 篩選獲得的較高產(chǎn)突變?cè)逯甑奈r青素產(chǎn)量Fig.4 Astaxanthin yield of the mutant strains with high yield was obtained

2.4 高產(chǎn)藻株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 高產(chǎn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖5 可知，光照強(qiáng)度對(duì)湖泊紅球藻生長(zhǎng)的影響較大。當(dāng)光照強(qiáng)度從1000 lx增強(qiáng)到2000 lx 時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著增大；當(dāng)光照強(qiáng)度為2000 lx 時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)最大值，為4.3倍；當(dāng)光照強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)從2000 lx 增加到3000 lx時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著減小。光照強(qiáng)弱可直接影響湖泊紅球藻的光合作用從而影響培養(yǎng)體系中的藻細(xì)胞數(shù)量，過(guò)高和過(guò)低的光照強(qiáng)度都不利于藻的生長(zhǎng)。因此，高產(chǎn)藻株HP3 的適宜光照強(qiáng)度為2000 lx。

圖5 光照強(qiáng)度對(duì)藻株HP3 生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of light intensity on the growth of HP3

由圖6 可知，在培養(yǎng)溫度為15～25 ℃時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率隨溫度升高而增大；在培養(yǎng)溫度為25～35 ℃時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率隨溫度升高而減小。當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)最大值，為4.6 倍。因此，湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株HP3 的適宜培養(yǎng)溫度為25 ℃。

圖6 溫度對(duì)藻株HP3 生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of HP3

MCM、BBM、BG11、TAP、HS 是常用的藻類培養(yǎng)基，MCM、BBM、BG11 培養(yǎng)基為藻類生長(zhǎng)提供NO3-作為N 源[21]，TAP、HS 培養(yǎng)基為藻類生長(zhǎng)提供NH4+作為N 源[24]。王曉丹等[27]的研究表明，以NaNO3為氮源培養(yǎng)雨生紅球藻生長(zhǎng)好于以NH4Cl為氮源。由圖7 可知，在培養(yǎng)基MCM、BBM、BG11 中，湖泊紅球藻生長(zhǎng)較好，其中在BBM 培養(yǎng)基中藻細(xì)胞生長(zhǎng)率最高。在培養(yǎng)基TAP、HS 中，湖泊紅球藻生長(zhǎng)較差，細(xì)胞生長(zhǎng)率低，這可能與培養(yǎng)基的N 源種類有關(guān)。因此，湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株HP3 的適宜培養(yǎng)基為BBM 培養(yǎng)基。

圖7 培養(yǎng)基對(duì)藻株HP3 生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of culture-medium on the growth of HP3

2.4.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由每個(gè)因素的3 個(gè)K 值大小比較得出，各因素的最佳水平為光照強(qiáng)度2000 lx、溫度25 ℃、培養(yǎng)基BG11，此組合正是5 號(hào)處理（A2B2C3）。由極差分析可以看出，各因素的主次順序?yàn)椋篈＞C＞B，在三個(gè)因素中，光照強(qiáng)度對(duì)湖泊紅球藻的生長(zhǎng)影響最大。優(yōu)化前的培養(yǎng)條件為4 號(hào)處理（A2B1C2），即光照強(qiáng)度2000 lx、溫度20 ℃、培養(yǎng)基BBM，培養(yǎng)條件優(yōu)化后藻細(xì)胞終密度提高了14.3%。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of the orthogonal experiment L9 (34)

2.4.2 高產(chǎn)藻株蝦青素誘導(dǎo)階段光照強(qiáng)度的篩選適宜的高光照條件是提高紅球藻蝦青素積累的重要方法[28-30]。由圖8 可以看出，高光脅迫能夠促進(jìn)湖泊紅球藻蝦青素的積累，當(dāng)光照強(qiáng)度為7000 lx 時(shí)，蝦青素產(chǎn)量為27.353 mg/L；光照強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)，蝦青素積累量也隨之增加；當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)10000 lx 時(shí)，蝦青素產(chǎn)量達(dá)最高，為31.264 mg/L；當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)10000 lx 時(shí)，蝦青素積累量反而減少，可能原因是光照太強(qiáng)引起活性氧產(chǎn)生過(guò)多導(dǎo)致藻細(xì)胞失活[12]?？梢?jiàn)，10000 lx 是湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株蝦青素誘導(dǎo)階段的最適光照強(qiáng)度，蝦青素產(chǎn)量較培養(yǎng)條件優(yōu)化前（26.212 mg/L）提高了19.3%。

圖8 光照強(qiáng)度對(duì)藻株HP3 蝦青素積累的影響Fig.8 Effect of light intensity on astaxanthin accumulation in HP3

2.5 高產(chǎn)藻株多次繼代后表型的觀察測(cè)定

湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株多次繼代后生長(zhǎng)良好。由圖9 可以看出，以1.2×105cell/mL 為起始培養(yǎng)密度，湖泊紅球藻能快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)12 d 即達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，培養(yǎng)14 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)7.1×105cell/mL，為初始培養(yǎng)時(shí)的5.92 倍。說(shuō)明HP3 藻株接種后適應(yīng)期短，能快速恢復(fù)生長(zhǎng)，呈現(xiàn)很好的分裂生長(zhǎng)能力。

圖9 藻株HP3 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段細(xì)胞密度的變化Fig.9 Changes in cell density in vegetative growth stage of HP3

由圖10 可以看出，湖泊紅球藻高光照脅迫處理之前蝦青素產(chǎn)量很低，僅為0.546 mg/L，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素產(chǎn)量逐漸增高，到21 d 時(shí)達(dá)到最大值（30.691 mg/L），為初始培養(yǎng)時(shí)的56.21 倍。說(shuō)明HP3 藻株在轉(zhuǎn)移至高光照前細(xì)胞狀態(tài)好，因此藻體蝦青素含量低，而后在高光照的誘導(dǎo)下不斷合成并累積蝦青素。

圖10 藻株HP3 蝦青素誘導(dǎo)階段蝦青素產(chǎn)量的變化Fig.10 Changes in astaxanthin yield in astaxanthin induction stage of HP3

綜上，湖泊紅球藻突變?cè)逯闔P3 在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下多次繼代后生長(zhǎng)快、蝦青素產(chǎn)量高，表型好；營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段培養(yǎng)14 d 后藻細(xì)胞密度和蝦青素誘導(dǎo)階段培養(yǎng)21 d 后蝦青素產(chǎn)量均與初代培養(yǎng)相當(dāng)，說(shuō)明遺傳穩(wěn)定性好。此等離子誘變篩選的湖泊紅球藻高產(chǎn)藻株可為后續(xù)的研究提供很好的種質(zhì)資源，為湖泊紅球藻產(chǎn)蝦青素的工業(yè)育種打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

藻類在人類生活及經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要的作用，藻類養(yǎng)殖中種質(zhì)是養(yǎng)殖質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵所在,藻類誘變育種是人工獲得優(yōu)良品系或品種的重要手段。本研究使用ARTP 誘變儀對(duì)湖泊紅球藻進(jìn)行等離子誘變，確定了等離子誘變的適宜條件是功率240 W、誘變時(shí)間150 s 或功率400 W、誘變時(shí)間120 s。通過(guò)初篩和復(fù)篩獲得了生長(zhǎng)最快、蝦青素產(chǎn)量最高的突變?cè)逯闔P3，培養(yǎng)后其藻細(xì)胞密度為6.4×105cell/mL，較出發(fā)株提高了25.5%；蝦青素產(chǎn)量為26.212 mg/L，較出發(fā)株提高了61.6%。湖泊紅球藻的誘變育種是一項(xiàng)有意義的長(zhǎng)期的系統(tǒng)工程，在下一步的研究中可以采用復(fù)合誘變方法以提高誘變頻率，擴(kuò)大誘變譜?？梢試L試使用ARTP 重復(fù)處理、ARTP+紫外線、ARTP+化學(xué)誘變等復(fù)合誘變方法對(duì)湖泊紅球藻進(jìn)行誘變，以獲取更高價(jià)值的突變?cè)逯辍?/p>

本研究對(duì)高產(chǎn)突變?cè)逯闔P3 進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的適宜培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000 lx、溫度25 ℃、培養(yǎng)基BG11；蝦青素誘導(dǎo)階段適宜的光照強(qiáng)度為10000 lx。在此條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段培養(yǎng)14 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)7.2×105cell/mL，較野生型藻株提高了41.2%；蝦青素誘導(dǎo)階段培養(yǎng)21 d 后蝦青素產(chǎn)量達(dá)31.264 mg/L，較野生型藻株提高了92.7%。實(shí)驗(yàn)采用等離子誘變結(jié)合培養(yǎng)條件的優(yōu)化使湖泊紅球藻的生物量顯著增加，蝦青素產(chǎn)量大幅提高，結(jié)果對(duì)選育湖泊紅球藻產(chǎn)蝦青素工業(yè)藻株及其實(shí)際應(yīng)用具有較大意義。