周雨晴， 朱葆華， 楊官品， 潘克厚,3??， 李 赟， 屠昌超， 曹延群

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島266003；3．青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)屬于大眼藻綱(Eustigmatophyceae)微擬球藻屬(Nannochloropsis)[1]，一般直徑 2～4 μm，是一種海洋單細胞真核微藻。由于其具有很高的光合作用速率，且生長速度快、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)含量高，引起了學者們的廣泛關(guān)注。為提高N.oceanica細胞得率和胞內(nèi)EPA含量，國內(nèi)外研究者已對其進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化[2-5]，包括培養(yǎng)時間、鹽度、pH、光照強度、氮源種類等。除此之外，某些除草劑能夠抑制EPA等長鏈多不飽和脂肪酸合成途徑中某些酶的活性。利用這種特性，可以在除草劑存在條件下，篩選到酶活性強、生命力旺盛且遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良藻株[6-9]。

Sandoz 9785又名baf3.338，化學名4-氯-5(二甲基氨基)-2-苯基-3(2H)噠嗪酮，是一種噠嗪酮類除草劑，可以抑制高等植物和藻類不飽和脂肪酸合成過程中△15去飽和酶(18:2ω6→18:3ω3)和△6去飽和酶(18:2ω6→18:3ω6)的活性[10-11]，且破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制電子傳遞[12]。已有研究表明，該除草劑可以篩選出高EPA含量的抗性藻株。鄒立紅等[7]用除草劑Sandoz 9785對紫外線誘變的后棘藻細胞進行處理，獲得的優(yōu)良藻株EPA含量比出發(fā)藻株顯著提高了212%。魏東等[13]在群體水平研究了Sandoz 9785對微擬球藻生長和積累EPA的影響。目前，尚未見利用該除草劑篩選抗性微擬球藻單克隆藻株及其葉綠素熒光參數(shù)和脂肪酸組成影響等方面的研究。本研究確定了Sandoz 9785篩選抗性微擬球藻的有效性，并成功篩選出了EPA含量較出發(fā)藻株顯著升高的優(yōu)良藻株。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)

本研究使用微擬球藻(N.oceanica)來源于本實驗室保存藻種，通過2次平板劃線分離出單細胞，進而純培養(yǎng)得到原始藻株用于本實驗。培養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃；日光燈光源，光照強度60～80 μmol·m-2·s-1；光照周期12 h∶12 h，每天早晚各搖瓶1次。

1.2 除草劑Sandoz 9785對微擬球藻敏感性分析

以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑配制濃度為100 μmol/mL的Sandoz 9785母液。實驗設(shè)置5個組，每組3個重復，向每組f/2固體培養(yǎng)基加入不同量的Sandoz 9785母液和DMSO，使除草劑的終濃度分別為0、50、52、54、56和58 μmol/L，DMSO的終濃度為0.058%。用f/2液體培養(yǎng)基稀釋指數(shù)生長期的微擬球藻至107個/L，取100 μL涂布平板，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 d后記錄平板內(nèi)的藻落數(shù)目。除草劑Sandoz 9785對微擬球藻生長的抑制率通過公式進行計算：W(%)=(對照組藻落數(shù)目-實驗組平板藻落數(shù)目)/對照組藻落數(shù)目×100%[9]。

1.3 微藻生長指標檢測

抗性微擬球藻的篩選 從Sandoz 9785濃度為58 μmol/L的固體平板上篩選出2個抗性藻株SA1、SA2，在無添加除草劑的液體f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至平臺期，再以相同起始密度接種用于后續(xù)實驗，每個藻株設(shè)3個重復。

生長曲線(Growth curve)繪制 用Hatachi U-3310型紫外分光光度計在750 nm波長下，每48 h測定藻液的吸光度值。

比生長速率(Specific growth rate) 通過公式K=(lnNt-lnN0)/(t2-t1)進行計算[9]，其中N0、Nt分別為實驗開始和結(jié)束時的吸光度值；t1和t2分別為實驗開始和結(jié)束的時間(d)。

1.4 葉綠素熒光參數(shù)測定

用德國Walz公司生產(chǎn)的Water-PAM水樣葉綠素熒光儀(Walz,Effeltrich,Germany)，分別選取指數(shù)期(第9天)和平臺期(第17天)的微擬球藻進行葉綠素熒光各個參數(shù)的測定。微藻樣品提前暗適應(yīng)15 min。葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP和NPQ可在熒光儀上直接讀出，F(xiàn)v/F0用公式(Fm-F0)/F0計算，其中F0(基礎(chǔ)熒光)用弱測量光(0.01 μmoL·m-2·s-1) 測量可得，F(xiàn)m(最大熒光)用飽和脈沖(4 000 μmol·m-2·s-1，持續(xù)時間為0.8 s) 激發(fā)可得。

1.5 脂肪酸組成測定

脂肪酸組成采用氣相色譜法[14]。準確稱取30 mg經(jīng)真空冷凍干燥的藻粉，加入1 mL KOH-CH3OH(2 mol/L)溶液，于75℃水浴30 min，冷卻至室溫。加入1.5 mL HCl-CH3OH(3 mol/L)溶液充分震蕩，75 ℃水浴30 min。冷卻至室溫后加入1 mL色譜純正己烷，充分震蕩，2 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清進行色譜分析。

脂肪酸組成分析采用美國Agilent 6890 series GC system氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測器和HP-5毛細管柱。進樣后程序升溫:150 ℃恒溫1 min，以15 ℃/min升到200 ℃，再以2 ℃/min升溫至250 ℃，保持25 min。進樣口溫度為270 ℃。載氣為高純氮，流速40 mL/min，進樣量5 μL。

2 結(jié)果

2.1 Sandoz 9785對微擬球藻的生長抑制效果

由表1可以看出，不同濃度的除草劑對微擬球藻具有不同程度的抑制作用，高濃度除草劑對微擬球藻抑制作用明顯，濃度為58 μmol/L時，平板中藻細胞抑制率達到99.1%。

表1 Sandoz 9785對微擬球藻生長的抑制作用Table 1 Inhibition of Sandoz 9785 to the growth of N.oceanica

2.2 抗性藻株及其評價

由圖1可以看出，SA1在前期生長較快，第3天OD值比出發(fā)藻株提高了13.59%(P<0.05)。SA1第6天后生長放緩，與出發(fā)藻株持平。SA2生長較快，第9、13天的OD值較出發(fā)藻株分別提高了6.99%和5.53%(P<0.05)比生長速率較出發(fā)藻株顯著提高了2.31%(見圖2)。

由表2和3可以看出，在指數(shù)生長期(第9天)，SA1和SA2的ΦPSⅡ、ETR、NPQ、Fv/Fm、Fv/F0值較出發(fā)藻株均有所提高，其中藻株SA1的NPQ、Fv/Fm、Fv/F0分別提高了74.6%、6.83%和21.15%(P<0.05)，藻株SA2的Fv/Fm、Fv/F0分別提高了3.17%、9.28%(P<0.05)。SA1和SA2的qP值均有所下降，但差異不顯著(P>0.05)。平臺期(第17天)，SA1、SA2的ΦPSⅡ、ETR、qP、Fv/Fm、Fv/F0值較出發(fā)藻都有所提高，其中SA1的NPQ顯著高于出發(fā)藻163.16%(P<0.05)，SA2 NPQ低于出發(fā)藻株但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 抗性藻株和出發(fā)藻株的生長曲線Fig.1 Growth curves of resistant strains and the original

(數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標準差，圖中標有不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。Values are expressed as mean±standard deviation. Different letters indicate significant difference(P< 0.05).)

圖2 抗性藻株和出發(fā)藻株的比生長速率Fig.2 Specific growth rate of resistant strains and the original

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).

表3 抗性藻株和出發(fā)藻株在平臺生長期的葉綠素熒光參數(shù)Table 3 The fluorescence parameters of resistant strains and the original at the plateau growth phase

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).

微擬球藻的脂肪酸主要由C14、C16、C18和C20組成(見表4)，飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)占總脂肪酸的60%以上。SA2的EPA (C20：5)含量低于出發(fā)藻株，SA1的EPA含量比出發(fā)藻株顯著提高了5.44%(P<0.05)，占總脂肪酸含量的27.35%。

表4 抗性藻株和出發(fā)藻株的脂肪酸含量Table 4 The fatty acid composition of resistant strains and the original /%

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05)

3 討論

本實驗中微擬球藻對除草劑Sandoz 9785非常敏感，濃度為58 μmol/L時，平板中的藻細胞生長抑制率達到99.10%。從中挑取生長良好的SA1、SA2單克隆藻落接種到新鮮的液體培養(yǎng)基中，SA1和SA2的生長速率較出發(fā)藻株均有所增加。

葉綠素熒光參數(shù)能反映植物光合作用過程中的光能吸收、電子傳遞、能量耗散和分配等過程[15]。研究發(fā)現(xiàn)，除草劑Sandoz 9785可以使植物光系統(tǒng)復合物從光合膜上脫落，影響細胞的光合作用。本實驗中，抗性藻株P(guān)SⅡ反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)和潛在活性(Fv/F0)均不同程度升高(見表2和3)，表明抗性藻株能抵抗除草劑對葉綠體PSⅡ結(jié)構(gòu)的破壞，恢復培養(yǎng)后2種藻株P(guān)SⅡ基本沒有受到傷害。ΦPSⅡ反映了PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉情況下實際原初光化學效率，ΦPSⅡ升高, 說明抗性藻細胞有較多同化力(NADPH，ATP)形成, 從而促進對碳的固定與同化[16]，這與抗性藻株比生長速率升高是一致的。非光化學淬滅(NPQ)是光系統(tǒng)Ⅱ天線色素吸收的過剩光能以熱能的形式耗散掉的部分。由于除草劑對葉綠體結(jié)構(gòu)具有破壞作用[18]，植物在脅迫條件下，葉綠素含量降低，電子傳遞受抑制導致活性氧積累，為降低活性氧增多而造成的損傷，酶促防御系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。高溫脅迫能提高花椰菜葉片中抗氧化酶(超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶、過氧化氫酶)的活性，減少活性氧的損傷[19]。在62.5～500 μmol/L Sandoz 9785存在條件下，為防止光氧化傷害，小麥幼苗(Wheat seedlings)NADPH谷胱甘肽還原酶活力提高了6～8倍[17]。本實驗中抗性藻株的非光化學淬滅(NPQ)顯著高于出發(fā)藻株(見表2和3)，說明抗性藻株具有更強的自我保護能力?？剐栽逯闟A2的NPQ值在平臺期略低于出發(fā)藻株，說明SA2具有較低的能量耗散。光化學淬滅(qP)表示PSⅡ天線色素吸收的光能用于化學電子傳遞的比例，與電子傳遞、光合氧化等過程直接相關(guān)。本實驗中，抗性藻株的qP值在指數(shù)期(第9天)略有下降，但差異并不顯著且在平臺期(第17天)明顯高于出發(fā)藻株，說明抗性藻株P(guān)SⅡQA重新氧化的能力較強，電子傳遞、光合氧化等效率較高。Sandoz 9785具有除草劑DCMU(二氯苯基二甲脲)類似的作用，它可以結(jié)合在PSⅡ光反應(yīng)中心蛋白D1蛋白的QB位點上,阻止QB還原,使電子傳遞速率失去平衡[17,23]。因此，在有除草劑存在的條件下，絕大多數(shù)藻細胞不能正常生長，但抗性藻株卻表現(xiàn)出更強的生命力和更加優(yōu)良的性狀(本實驗中SA1的EPA含量增加，SA2的比生長速率升高)。從葉綠素熒光參數(shù)(ΦPSⅡ、ETR、Fv/Fm、Fv/F0)來看，SA1提高顯著但比生長率卻略低于出發(fā)藻株，由于SA1的非光化學淬滅(NPQ)顯著高于出發(fā)藻株，PSⅡ中心天線色素吸收的光能較大一部分以熱的形式耗散掉了，導致其生長速率變慢，EPA合成增加。

藻類長鏈多不飽和脂肪酸是在一系列去飽和酶和延伸酶作用下合成的。微擬球藻EPA的合成途徑已有一些報道。由圖3可以看出，從C18:2開始，主要有 n-6和 n-3兩條途徑合成EPA[20]，Δ15去飽和酶與Δ6去飽和酶在其中發(fā)揮重要作用，Sandoz 9785主要通過抑制這2個酶的活性從而對EPA的合成產(chǎn)生影響。Cohen等[10]從紫球藻中篩選到Sandoz 9785抗性藻株,其EPA的含量從野生型的36.8%提高到40.4%，并可在無Sandoz 9785存在下穩(wěn)定遺傳50代以上。魏東等[13]在群體水平研究了Sandoz 9785對微擬球藻的影響,得到抗性藻株EPA含量占細胞干重的3.51%，比野生株提高了30%。鄒立紅等[7]通過Sandoz 9785對紫外誘變的后棘藻細胞進行篩選，獲得5株高產(chǎn)EPA的藻株，其中一株藻的EPA含量達總脂肪酸的26.22%，較出發(fā)藻株提高了212%。

圖3 微擬球藻多不飽和脂肪酸(EPA)生物合成途徑[20,22]Fig. 3 Proposed PUFA biosynthesis pathway in N.oceanica[20,22]

到目前為止，有關(guān)微藻抗除草劑以及抗性藻株積累EPA的機理研究得還不夠深入。已有的研究結(jié)果表明，抗性細胞中相關(guān)酶類經(jīng)過修飾后，可能降低對抑制劑的親和性，或者提高了相關(guān)酶基因的表達水平，酶活性升高[10]。本研究中，在含有除草劑Sandoz 9785的平板上正常生長的抗性藻株SA1和SA2，在無除草劑條件下培養(yǎng)，SA1EPA含量比出發(fā)藻株顯著提高了5.44%，占總脂肪酸含量的27.35%, SA2 EPA含量略低于出發(fā)藻?？剐栽逯闑PA含量發(fā)生變化，有以下幾種可能：(1)因為Δ15去飽和酶或Δ6去飽和酶的活性增強，促進C18:2轉(zhuǎn)化為C18:3用于后續(xù)合成EPA，后面的研究將對相關(guān)酶基因的表達水平及酶活性進行測定；(2)抗性藻株SA1在Sandoz 9785脅迫條件下，激活了一個在正常情況下不會發(fā)生作用的途徑，即C18:2通過C20:2(n-6) 轉(zhuǎn)化為C20:4(n-6)[13,22]，進而合成EPA；(3)Sandoz 9785能抑制葉綠體上Δ15去飽和酶的活性，對細胞質(zhì)中EPA合成過程沒有影響[21]，而微擬球藻EPA只在細胞質(zhì)中合成[20]，同時，Sandoz 9785能抑制微擬球藻的光合作用，使光合作用顯著增強的藻株得以存活，因此，通過該除草劑可篩選到EPA含量不同的抗性藻株。

目前，已有研究表明Sandoz 9785對藻細胞的作用機理主要有三方面，(1)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，使光系統(tǒng)Ⅱ脫落[18]；(2)作用PSⅡ光反應(yīng)中心蛋白D1蛋白的QB位點上 ,阻止QB的還原[17,23]；(3)抑制EPA合成通路中Δ15去飽和酶與Δ6去飽和酶的活性[10-11]。由于Sandoz 9785對藻細胞具有多種抑制作用，因此，可能獲得生長速率提高或者EPA合成增加的優(yōu)良藻株。本實驗中，相對于出發(fā)藻株,SA1 EPA含量顯著提高、比生長速率略低，SA2 EPA含量沒有提高，比生長速率顯著提高。由于SA1的EPA含量顯著提高且比生長速率與出發(fā)藻株差異不顯著，因此，達到了利用該除草劑篩選高EPA微擬球藻的目的。在后續(xù)實驗中，我們會對SA1多次傳代，觀察其性狀的穩(wěn)定性。

4 結(jié)語

本實驗中篩選到抗性藻株SA1、SA2，將其接入液體f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測得其葉綠素熒光參數(shù)(ΦPSⅡ、ETR、Fv/Fm、Fv/F0)均高于出發(fā)藻株(見表2、3)，表明抗性藻株的PSⅡ基本沒有受到除草劑的損害，其PSⅡ的實際光能轉(zhuǎn)化效率和光合電子傳遞效率均有提高，其中SA2的比生長速率高于出發(fā)藻株，SA1的EPA含量顯著高于出發(fā)藻株。本研究通過Sandoz 9785篩選到了EPA含量較高的優(yōu)良微擬球藻，研究結(jié)果為篩選其他EPA含量較高的藻株提供參考。

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