李露露，焦 宇，姜 敏，李秋月，吳朋烊，馬淑麗，鄭曉宇，趙容杰，趙正林

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

酒精中毒（Alcoholism）的危害極大，但其治療成功率極低[1]。酒精中毒患者戒酒一段時(shí)間后復(fù)飲是其治療的最大難點(diǎn)，而酒精戒斷（EtOH Withdrawal，EtOHWI）引起的情感障礙是導(dǎo)致復(fù)飲的根源之一[2]。臨床研究和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究表明，EtOHWI 后酒精中毒患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均表現(xiàn)出顯著的焦慮障礙（癥），為了緩解此癥狀的痛苦，酒精中毒患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)覓酒和重新飲酒[3-4]。目前臨床上應(yīng)用的治療酒精中毒的藥物地西泮或勞拉西泮等苯二氮卓類藥物主要通過緩解患者的焦慮癥而實(shí)現(xiàn)其治療效果[5]。雖然此類藥物表現(xiàn)出一定的療效，但其本身具有較強(qiáng)的成癮性[6]，繼而很大限制其進(jìn)一步使用。很顯然，研發(fā)具有良好的抗焦慮效應(yīng)，并且無成癮性的新藥是目前酒精中毒治療所面臨的重大課題。

異澤蘭黃素（Eupatilin，Eptl），中藥艾葉中的重要黃酮類成份，也廣泛存在于多種菊科蒿屬類植物中[7]，而艾葉在民間常被做食用原料或佐料使用[8]。已知Eptl 具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[9-10]，并且發(fā)現(xiàn)Eptl 通過海馬（Hippocampus，Hippo）的神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)和抗炎等機(jī)制抑制小鼠抑郁樣行為[11-12]。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，分布著大量的γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)[13]，而GABAaR 是酒精的主要作用點(diǎn)，且GABA 能神經(jīng)功能紊亂是導(dǎo)致大量飲酒所致情感障礙的重要因素[14]。因此，本研究首先在行為和應(yīng)激激素的角度觀察Eptl 對(duì)大鼠EtOHWI 焦慮樣行為的作用，以vHippo 的GABA 能神經(jīng)傳遞功能變化、炎癥和氧化應(yīng)激等作為靶點(diǎn)探討Eptl 的作用機(jī)制，旨在為Eptl 研發(fā)成新的抗EtOHWI 焦慮癥的藥物提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 隨機(jī)選取8 周齡，體重均為200～220 g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2021-013。實(shí)驗(yàn)大鼠均在20～23 ℃，濕度40%～50%，具有自動(dòng)空氣清潔設(shè)備的專用IVC 鼠籠飼養(yǎng)，自由飲水飲食。本實(shí)驗(yàn)已通過齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：QMU-AECC-2023-68），且所有操作均按照相關(guān)指南執(zhí)行；小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22

以含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的Dulbecco's modified Eagle's medium 高糖培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，BeNa Culture Collection；異澤蘭黃素（純度≥98%）成都德斯特生物科技有限公司；總蛋白測(cè)定試劑盒、MDA、CAT、T-SOD、GSH 檢測(cè)試劑盒、Nrf2 抗體 碧云天生物技術(shù)公司；HO-1 抗體 Santa Cruz Biotechnology；GABAaRα1、GABAaRα2 抗體 索萊寶科技有限公司；大鼠CORT、大鼠GABA、大鼠TNF-α、大鼠IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

RL20170223 大鼠曠場(chǎng)（Open field，OF）實(shí)驗(yàn)箱、RL20170210 高架十字迷宮（Elevated plus maze，EPM）上海軟隆科技發(fā)展有限公司；多功能酶標(biāo)儀奧地利Tecan 公司；1658001 小型垂直電泳槽、1703935 電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國BIO-RAD 公司；UVP Chemstudio touch 多功能成像儀、qTOWER3G 熒光定量梯度基因擴(kuò)增儀 德國Analytikjena 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的分組、模型建立和給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4 組，分別為生理鹽水對(duì)照組、酒精戒斷（EtOHWI）模型組、Eptl 低劑量治療組和Eptl 高劑量治療組，每組各8 只。除生理鹽水對(duì)照組外，其余各組每天1 次腹腔注射3 g/kg EtOH（稀釋于生理鹽水，20%的容積比），共28 d。戒斷3 d 制備EtOHWI 模型，生理鹽水對(duì)照組以生理鹽水代替EtOH[15]。在戒斷3 d 期間，每天對(duì)Eptl 低劑量治療組（10 mg/kg）和Eptl 高劑量治療組（30 mg/kg）分別灌胃1 次[16]（Eptl 灌胃前先溶解于二甲基亞砜，后用生理鹽水進(jìn)行稀釋）。生理鹽水對(duì)照組和EtOHWI 模型組灌胃生理鹽水。在第3 次給藥30 min 后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行OF 和EPM 檢測(cè)，觀察行為學(xué)變化。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè) 曠場(chǎng)試驗(yàn)（OF）：首先，將各組大鼠放置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的正中央?yún)^(qū)域（50 cm×50 cm×50 cm），采用視頻系統(tǒng)開始記錄5 min 內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。觀察指標(biāo)為：中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)距離（mm）及活動(dòng)時(shí)間（s）[17]；高架十字迷宮試驗(yàn)（EPM）：EPM 由從地面50 cm 升高的十字形長寬（50 cm×10 cm）相同的開放臂（無側(cè)壁）和閉合臂（有側(cè)壁）垂直交叉構(gòu)成。OF 檢測(cè)結(jié)束10 min 后進(jìn)行EPM 實(shí)驗(yàn)，將各組大鼠放置于迷宮中央?yún)^(qū)域，頭均朝向開放臂方向，采用視頻系統(tǒng)開始記錄5 min 內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。觀察指標(biāo)為：開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比（%）和開放臂滯留時(shí)間百分比（%）。行為學(xué)檢測(cè)期間實(shí)驗(yàn)室保持通風(fēng)安靜，每只大鼠檢測(cè)后，用0.1%醋酸擦干儀器除味[18]。

1.2.3 血清中CORT 含量測(cè)定 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，大鼠安樂死后收集血液至1.5 mL 離心管中，在4 ℃、3000 r/min 離心15 min 后收集血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)CORT 水平，結(jié)果以ng/mL 表示。

1.2.4 vHippo 中GABA 含量測(cè)定 大鼠安樂死處理后取出大腦，根據(jù)大鼠腦定位圖譜[19]，分離出vHippo并稱重，按5%的比例于PBS 中充分勻漿，8000 r/min離心10 min，收集上清嚴(yán)格按照大鼠GABA 測(cè)定試劑盒說明書檢測(cè)GABA 水平，結(jié)果以μmol/L 表示。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá) 將收集的vHippo于RIPA 蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制劑）中充分研磨，12000 r/min 離心5 min 取上清液，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并按照常規(guī)操作方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，再加入Ⅱ抗室溫?fù)u床孵育2 h 后，用ECL 顯色，利用多功能凝膠成像系統(tǒng)掃描并用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.6 vHippo 中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子的測(cè)定將收集的vHippo 按10%的比例于PBS 中充分勻漿，3000 r/min 離心20 min，收集上清嚴(yán)格按試劑盒說明書分別檢測(cè)vHippo 中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、T-SOD、CAT 和GSH 水平以及炎癥因子IL-6 和TNF-α。

1.2.7 qPCR 檢測(cè)vHippo 中GAD67 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 將收集的vHippo 采用Trizol Reagent 法提取RNA 并檢測(cè)其濃度和純度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；蛞镄蛄腥缦拢篏AD67，F(xiàn)orward：CATCATGGCGGCTGGTACAC AG；Reverse：GTGACTGTGTTCTGAGGTGAAGA GG。GAPDH，F(xiàn)orward：AATCCTGGGCGGTACA ACTC；Reverse：GTTCACACCGACCTTCACCA。qPCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、15 S，退火55 ℃、30 S，延伸72 ℃、20 S，共進(jìn)行43個(gè)循環(huán)，然后計(jì)算△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=處理組△Ct-對(duì)照組△Ct，最后計(jì)算2-△△Ct值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8 MTT 法檢測(cè)HT22 細(xì)胞活力 根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法，收集生長狀態(tài)良好的HT22 細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，以每孔4×103個(gè)接種于96 孔板中，每孔100 μL，加入不同濃度（50、100、200、400、800、1000 μmol/L）的H2O2培養(yǎng)24 h。準(zhǔn)備相同細(xì)胞加入不同濃度（3、10、30、60 μmol/L）的Eptl 培養(yǎng)24 h。接種相同細(xì)胞，預(yù)處理組加入30 μmol/L 的Eptl 預(yù)處理2 h，與H2O2模型組同時(shí)給予200 μmol/L H2O2刺激，培養(yǎng)24 h，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。然后加入10 μL MTT染色液，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，每孔加100 μL Formanzan 溶解液繼續(xù)孵育5 h待結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 處吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活力，篩選最佳H2O2和Eptl處理濃度。

1.2.9 HT22 細(xì)胞分組、給藥以及免疫熒光實(shí)驗(yàn) 收集生長狀態(tài)良好的HT22 細(xì)胞，爬片到經(jīng)組織培養(yǎng)物處理的圓形玻片上，分為Control 組（空白組）、H2O2模型組（200 μmol/L H2O2）和Eptl 預(yù)處理組（30 μmol/L Eptl+200 μmol/L H2O2）。Eptl 預(yù)處理組以30 μmol/L Eptl 預(yù)處理2 h 后，與模型組同時(shí)給予200 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，空白組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。造模完成后經(jīng)PBS 潤洗3 min，10%中性甲醛固定40 min，0.1% Triton-X 穿透10 min，5% BSA 封閉0.5 h，加入Nrf2 Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，DAPI核染色10 min，抗熒光淬滅劑封片后于倒置熒光顯微鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way，ANOVA），組間兩兩比較采用Newman-Keuls 法進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠行為學(xué)變化的影響

OF 是利用嚙齒類動(dòng)物對(duì)開闊的新異環(huán)境的恐懼和探究能力來反映動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)情況和焦慮心理。EPM 是利用嚙齒類動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究能力和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來檢測(cè)動(dòng)物的焦慮狀態(tài)[21-22]。由表1 可知，在OF 檢測(cè)中，EtOHWI 模型組大鼠在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)距離和活動(dòng)時(shí)間均極顯著低于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.01）；與EtOHWI 組比較，Eptl 低、高劑量治療組大鼠在OF 中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離極顯著增加（P＜0.01），分別為70.62%和124.21%，活動(dòng)時(shí)間顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），分別為251.75%和371.62%；在EPM 檢測(cè)中，EtOHWI 模型組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和開放臂滯留時(shí)間百分比均極顯著低于（P＜0.01）生理鹽水對(duì)照組；與EtOHWI 模型組比較，Eptl 低、高劑量治療組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），分別為110.33%和207.32%，滯留時(shí)間百分比顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），分別為99.56%和184.18%，表現(xiàn)出大鼠對(duì)開放臂的探索趨勢(shì)顯著升高；在組間兩兩比較中，Eptl 高劑量治療組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)和開放臂滯留時(shí)間百分比均顯著高于（P＜0.05）低劑量治療組，說明Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠焦慮樣行為的治療具有劑量依賴性。上述檢測(cè)指標(biāo)提示，大鼠EtOHWI 焦慮樣模型制備成功。在EtOHWI期給予Eptl 治療后，焦慮樣行為顯著減輕。

表1 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠行為學(xué)變化的影響（n=8）Table 1 Effect of eupatilin on the changes of EtOHWI rats (n=8)

2.2 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠血清CORT 水平、vHippo中GABA 含量的影響

下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA）是機(jī)體內(nèi)最為重要的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之一。HPA 軸中CORT 含量變化可作為直接評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物焦慮程度的重要指標(biāo)，兩者呈正相關(guān)[23]。如表2 所示，各組大鼠血清CORT 檢測(cè)結(jié)果如下。與生理鹽水對(duì)照組比較，EtOHWI 模型組大鼠血清CORT 含量極顯著升高（P＜0.01）；與EtOHWI模型組比較，Eptl 低、高劑量治療組血清CORT 水平均極顯著降低（P＜0.01）；組間兩兩比較顯示，Eptl低、高劑量治療組間CORT 水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明兩者具有極顯著的劑量依賴性，說明Eptl 顯著降低了EtOHWI 大鼠血清CORT 的上升趨勢(shì)，減輕了對(duì)EtOH 戒斷焦慮樣行為。GABA是大腦中廣泛分布的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，EtOH 與GABA相互作用會(huì)增強(qiáng)EtOH 的負(fù)性強(qiáng)化作用，在EtOH 成癮和依賴中起著重要作用。苯二氮卓類藥物鎮(zhèn)靜、抗焦慮和抗驚厥作用與GABA 系統(tǒng)的激活有關(guān)，本研究結(jié)果與之呼應(yīng)[24]。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組比較，EtOHWI 模型組大鼠vHippo 中GABA 含量極顯著降低（P＜0.01）；與EtOHWI 模型組比較，Eptl 低、高劑量治療組vHippo 中GABA 含量均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。此結(jié)果說明，在EtOHWI 大鼠發(fā)病過程中vHippo 中GABA 的降低會(huì)導(dǎo)致焦慮樣行為，而Eptl 可通過上調(diào)vHippo 中GABA 水平改善EtOHWI 大鼠焦慮樣行為。

表2 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠血清CORT 水平、vHippo 中GABA 含量的影響（n=8）Table 2 Effects of eupatilin on the level of serum CORT and the ventral hippocampal GABA content concentration of EtOHWI rats (n=8)

2.3 Eptl 對(duì)EtOHWI 大 鼠vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響

GABAaR 是維持和控制大腦神經(jīng)元興奮的關(guān)鍵蛋白，GABA 通過與其受體GABAaR 結(jié)合發(fā)揮生理功能，焦慮癥的發(fā)生與GABAaRα1、GABAaRα2 的改變密切相關(guān)[25-26]。長期的EtOH 依賴或戒斷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，其中Nrf2/HO-1 是氧化應(yīng)激反應(yīng)重要的信號(hào)通路。Western blot 檢測(cè)結(jié)果如圖1，與生理鹽水對(duì)照組比較，EtOHWI 模型組大鼠vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2 和HO-1蛋白表達(dá)極顯著減少（P＜0.01）；與EtOHWI 模型組比較，Eptl 低、高劑量治療組大鼠vHippo 中GABAa-Rα1、GABAaRα2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；組間兩兩比較顯示，Eptl 低、高劑量治療組間GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），具有劑量依賴性。由此可推斷，GABAaRα1、GAB AaRα2 蛋白下調(diào)可能是介導(dǎo)EtOHWI 焦慮癥的重要機(jī)制，而Eptl 能糾正其紊亂發(fā)揮抑制EtOHWI 焦慮樣行為的效應(yīng)。Nrf2/HO-1 抗氧化系統(tǒng)可能參與了Eptl 的抗氧化過程從而保護(hù)了vHippo 氧化應(yīng)激的損傷。

圖1 各組大鼠vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)（n=8）Fig.1 Protein expression of ventral hippocampal GABAaRα1,GABAaRα2,Nrf2 and HO-1 of each group rats (n=8)

2.4 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠vHippo 中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子水平的影響

各組實(shí)驗(yàn)大鼠vHippo 中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子的變化如表3 所示，與生理鹽水對(duì)照組比較，EtOHWI 模型組大鼠vHippo 中MDA 水平呈極顯著升高（P＜0.01），而T-SOD、CAT、GSH 活性極顯著降低（P＜0.01））；與EtOHWI 模型組比較，Eptl 低、高劑量治療組大鼠vHippo 中MDA 水平極顯著降低（P＜0.01），T-SOD、CAT、GSH 活性顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；在組間兩兩比較中，Eptl 高劑量治療組大鼠較Eptl 低劑量治療組vHippo 中MDA水平顯著降低（P＜0.05），有劑量依賴性。在炎癥因子的檢測(cè)中，EtOHWI 模型組大鼠vHippo 中IL-6、TNF-α含量較生理鹽水對(duì)照組極顯著升高（P＜0.01），而Eptl 低、高劑量治療組大鼠vHippo 中IL-6、TNF-α含量較EtOHWI 模型組大鼠顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；在組間兩兩比較中，Eptl 高劑量治療組大鼠較Eptl 低劑量治療組vHippo 中TNF-α顯著降低（P＜0.05），表現(xiàn)出劑量依賴性。因此可以推斷，EtOHWI 期大鼠vHippo 中發(fā)生了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，失去了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)了vHippo中GABA 能神經(jīng)傳遞的紊亂，進(jìn)一步說明EtOHWI焦慮癥發(fā)病機(jī)制中大腦vHippo 中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要作用。Eptl 治療后vHippo 中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子水平紊亂得到顯著改善，緩解了EtOHWI 對(duì)大鼠vHippo 的損傷。

表3 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠vHippo 氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子水平的影響（n=8）Table 3 Effects of eupatilin on the oxidative stress and inflammatory factors in ventral hippocampal of EtOHWI rats (n=8)

2.5 Eptl 對(duì)EtOHWI 大鼠vHippo 中GAD67 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

qPCR 檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示，與生理鹽水對(duì)照組比較，EtOHWI 模型組大鼠vHippo 中GAD67 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著減少（P＜0.01）；與EtOHWI 模型組比較，Eptl 低、高劑量治療組大鼠vHippo 中GAD67 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；組間兩兩比較顯示，Eptl 低、高劑量治療組間GAD67 mRNA 相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有劑量依賴性。此結(jié)果進(jìn)一步說明了GABAa 神經(jīng)傳遞紊亂可能是介導(dǎo)EtOHWI 焦慮癥的重要機(jī)制，給予Eptl 可以恢復(fù)GABAa 神經(jīng)的生理功能，減輕EtOHWI 給機(jī)體帶來的損傷，緩解焦慮癥狀。

圖2 各組大鼠vHippo 中GAD67 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（n=8）Fig.2 Relative expression of ventral hippocampal GAD67 mRNA of each group rats (n=8)

2.6 Eptl 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞活力的影響

如圖3 所示，H2O2和Eptl 單獨(dú)處理后觀察對(duì)HT22 細(xì)胞活力的影響，H2O2最適刺激濃度為200 μmol/L，Eptl 預(yù)處理濃度為30 μmol/L。與空白組比較，H2O2模型組細(xì)胞活力極顯著降低（P＜0.01）；與H2O2模型組比較，30 μmol/L Eptl 預(yù)處理組的細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.01）。

圖3 Eptl 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞活力的影響（n=3）Fig.3 Effect of eupatilin on the viability of H2O2-induced HT22 cells (n=3)

2.7 Eptl 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞中Nrf2 表達(dá)的影響

如圖4 所示，Control（空白）組中，Nrf2 主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，胞核中表達(dá)極少，而H2O2模型組胞核中Nrf2 的表達(dá)較Control 組極顯著升高（P＜0.01）；與H2O2模型組比較，Eptl 預(yù)處理組細(xì)胞核中Nrf2 的表達(dá)顯著減少（P＜0.05），且與Control（空白）組比較，并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 Eptl 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞中Nrf2 表達(dá)的影響（200×，n=3）Fig.4 Effect of eupatilin on the expression of H2O2-induced HT22 cells (200×,n=3)

3 討論與結(jié)論

酒精中毒會(huì)引起酒精依賴，戒斷會(huì)導(dǎo)致睡眠障礙、焦慮和抑郁等精神癥狀，給社會(huì)和個(gè)人的生活帶來嚴(yán)重的危害[27]。本研究發(fā)現(xiàn)EtOHWI 期給予Eptl對(duì)抑制大鼠的EtOHWI 焦慮樣行為有積極作用。EtOHWI 期血液中 CORT 水平增高被認(rèn)為是大鼠焦慮的激素學(xué)基礎(chǔ)[27]。本研究中觀察到EtOHWI 大鼠血清CORT 水平的極顯著升高（P＜0.01），且兩個(gè)劑量的Eptl 均可有效地抑制其增高，此結(jié)果不僅從激素學(xué)角度支持了Eptl 抗EtOHWI 焦慮的行為學(xué)的作用，而且與行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果相印證初步確定了Eptl對(duì)EtOHWI 焦慮樣行為的改善作用。

本研究在不同角度探討Eptl 的抗焦慮作用機(jī)制，其中vHippo 作為EtOHWI 焦慮癥的解剖組織學(xué)靶點(diǎn)，解釋了Eptl 作用機(jī)制。Hippo 是學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的關(guān)鍵部位，也是介導(dǎo)焦慮等情感障礙的重要結(jié)構(gòu)，分布有大量的GABAaR[28-29]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS），GABA 從突觸前膜被釋放后，與突觸后膜的GABAaR 結(jié)合而發(fā)揮抑制神經(jīng)傳遞作用，因此，GABA 合成和釋放以及GABAaR 表達(dá)直接影響GABAaR 傳遞效應(yīng)[30-31]。GAD65 和GAD67 是中樞GABA 合成的限速酶，后者一般以功能飽和狀態(tài)存在，主要負(fù)責(zé)胞漿內(nèi)的GABA 合成，但前者多數(shù)受到一些刺激后才被激活發(fā)揮作用。因此，組織的GABA 水平主要由GAD67表達(dá)量所決定[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，情感障礙患者的Hippo 存在GAD67 的顯著下調(diào)并伴有GABAaR 傳遞異常[34]，表明GABA 合成能力下降是其發(fā)病機(jī)制之一。在Hippo，GABAaR 和GABAbR 是介導(dǎo)GABA 神經(jīng)傳遞的主要受體，其中GABAaR 作為抑制性離子通道受體的代表，是介導(dǎo)EtOH 中樞作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。GABAaR 是由5 個(gè)亞基圍繞一個(gè)中心氯離子通道的五聚體，有19 種亞型，分布于不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有特定的生理功能[35]。苯二氮卓類藥物正是通過增強(qiáng)GABA 與其受體的結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠和抗焦慮作用，尤其在海馬中體現(xiàn)[36-37]。在本研究中，EtOHWI 大鼠模型vHippo 的GABA 水平極顯著降低（P＜0.01），并伴有GAD67 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的減少，表明在EtOHWI 期，GABA 合成與釋放減少，同時(shí)，EtOHWI 大鼠vHippo 中GABAaR 的α1和α2 亞基蛋白表達(dá)量均極顯著減少（P＜0.01），這些結(jié)果與上述其它研究者的結(jié)果一致。綜上，vHippo的GABAa 神經(jīng)傳遞功能下降是介導(dǎo)EtOHWI 焦慮癥重要機(jī)制，而Eptl 通過改善其發(fā)揮抗EtOHWI 焦慮癥的效應(yīng)。

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激存在相互作用，它們所致的損傷通常被認(rèn)為是，長期飲用EtOH 或EtOHWI導(dǎo)致的CNS（包括Hippo ）功能紊亂的潛在因素。Jeong 等[12]曾在研究中發(fā)現(xiàn)，Stillen（Eptl 的別名）可降低Hippo 的IL-6 和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)以發(fā)揮抗小鼠抑郁癥的效應(yīng)。在本研究發(fā)現(xiàn)，EtOHWI大鼠模型vHippo 的IL-6 和TNF-α與生理鹽水對(duì)照組相比，極顯著升高（P＜0.01），而戒斷期低高劑量Eptl 的治療均顯著抑制了這些現(xiàn)象，表明Eptl 良好的抗炎作用可能是保護(hù)或逆轉(zhuǎn)長期飲用EtOH 或戒斷期vHippo 的GABAa 神經(jīng)傳遞損傷的基本機(jī)制之一。與此相似，Tiwari 等[38]的研究也發(fā)現(xiàn)，長期EtOH 引起Hippo 的氧化應(yīng)激損傷因子的表達(dá)增多，而白藜蘆醇通過緩解氧化應(yīng)激損傷等機(jī)制改善長期EtOH 所致大鼠認(rèn)知障礙。同樣，在本研究中，檢測(cè)到EtOHWI 模型大鼠vHippo 的MDA 水平增高，而CAT 和T-SOD 的活性降低，且Eptl 低、高劑量治療顯著改善氧化應(yīng)激損傷，表明Eptl 的抗氧化應(yīng)激作用也可能是它保護(hù)vHippo 的GABAa 神經(jīng)傳遞治療EtOHWI 焦慮癥的重要機(jī)制之一。Nrf2/HO-1 是細(xì)胞中重要的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，本研究檢測(cè)了vHippo的HO-1 和Nrf2 的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EtOHWI 模型大鼠vHippo 的此兩種蛋白表達(dá)有極顯著降低（P＜0.01），但Eptl 治療顯著提高了它們的表達(dá)（P＜0.05），表明Nrf2/HO-1 抗氧化系統(tǒng)可能參與Eptl 的抗氧化過程，此結(jié)果與課題組前期的研究相符合[20]，也在本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步得到了證實(shí)。在利用嚙齒類Hippo 來源的HT22 細(xì)胞進(jìn)行的熒光免疫染色中發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)組的HT22 細(xì)胞中Nrf2 向細(xì)胞核內(nèi)的進(jìn)入量極顯著增多（P＜0.01），通常Nrf2 存在于胞漿內(nèi)，與胞質(zhì)接頭蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合在一起。當(dāng)氧化應(yīng)激或一些信號(hào)因子存在的情況下，Nrf2 與Keap1 分離進(jìn)入到胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件（Antioxident responseelement，ARE）結(jié)合啟動(dòng)HO-1 和NQO-1 等抗氧化因子的轉(zhuǎn)錄過程[39]。因此，此結(jié)果顯示HT22 受到氧化應(yīng)激攻擊時(shí)的細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，但在同樣的免疫熒光染色中發(fā)現(xiàn)，30 μmol/L Eptl 預(yù)處理的HT22 細(xì)胞中Nrf2 進(jìn)入胞核的量反而減少，說明此濃度的Eptl 預(yù)處理通過某種機(jī)制減弱了H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的攻擊，保護(hù)了HT22 受到氧化應(yīng)激的損傷。上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果和組織中 Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的結(jié)果綜合說明了，EtOHWI 期間存在 vHippo 的抗氧化應(yīng)激保護(hù)通路紊亂，而Eptl 通過糾正和改善這些紊亂緩解氧化應(yīng)激對(duì)GABAa 傳遞的損傷，進(jìn)而表現(xiàn)出抑制EtOHWI 焦慮癥的療效。

綜上所述，本研究得出EtOHWI 期給予Eptl 能緩解EtOHWI 大鼠焦慮樣行為，這種效應(yīng)可能通過Eptl 的抗炎抗氧化作用所介導(dǎo)，從而改善大鼠 vHippo的 GABAaR 傳遞紊亂。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Eptl可能成為治療EtOHWI 焦慮癥及酒精中毒的新藥研發(fā)提供新的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和依據(jù)，且考慮到艾葉是民間常用的食用原料和佐料，本研究的結(jié)果也為艾葉的藥用和保健作用增添新的科學(xué)依據(jù)。

客座主編

楊栩，男，食品科學(xué)與工程博士后，高級(jí)工程師，現(xiàn)任天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院食品安全風(fēng)險(xiǎn)研究中心主任。研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取、結(jié)構(gòu)表征、生物活性，藥食同源功能性食品研制和功效安全性評(píng)價(jià)。天津市醫(yī)療健康學(xué)會(huì)第一屆精準(zhǔn)檢測(cè)專業(yè)委員會(huì)副主任委員、《精細(xì)化工》和《食品工業(yè)科技》青年編委、Bentham 科學(xué)出版社大使、國家市場(chǎng)監(jiān)管總局技術(shù)保障專項(xiàng)、科研成果獎(jiǎng)評(píng)審專家、天津市健康科普專家、天津市食品安全抽檢監(jiān)測(cè)專家。主持承擔(dān)國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家科技重大專項(xiàng)、食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)、天津重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家市場(chǎng)監(jiān)管總局等國家/省部級(jí)項(xiàng)目12 項(xiàng)。以第一/通訊作者在Food Chemistry、International Journal of Biological Macromolecules等期刊發(fā)表論文20 余篇，獲批國家發(fā)明專利1 項(xiàng)。

彭鑫，博士，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，2016 年～2017 年曾在美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校進(jìn)行公派訪學(xué)。研究方向?yàn)樗幨惩次镔|(zhì)中天然產(chǎn)物的提取分離、篩選制備與功能研究。主持國家自然科學(xué)基金、天津市自然基金等項(xiàng)目10 余項(xiàng)，以第一/通訊作者在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Chemistry和Food &Function等期刊發(fā)表論文30 余篇，其中JCR 一、二區(qū)論文20 余篇，ESI 高被引論文1 篇。兼任《食品工業(yè)科技》和《中國調(diào)味品》青年編委，馬來西亞碩士學(xué)位論文海外評(píng)審專家，擔(dān)任多個(gè)SCI 高水平期刊審稿人。2016 年入選天津大學(xué)“北洋學(xué)者青年骨干教師計(jì)劃”和天津市“131”人才計(jì)劃第三層次人才。