康霄文 杜曉華 王東偉 程菊娥 王忠勇 孫書娥 蘇品 劉勇

摘 要：研究基于沼澤紅假單胞菌PSB-06促生和增強寄主抗病性，蘇云金芽孢桿菌KY-1抗逆性強等優(yōu)點，采用原生質體融合技術獲得這2種菌株的融合菌株，測定了融合菌株對生姜根結線蟲的防治效果，以期得到綜合親本優(yōu)良性狀的新型高效生防菌株。結果表明：融合菌株顯著降低了土壤根結線蟲的數(shù)量，收獲期相對防效達73.68%；融合菌株處理顯著提高了生姜的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和品質，單株姜球數(shù)（13.80個）、姜球寬度（33.47 cm）和單株產(chǎn)量（1.29 kg）均優(yōu)于空白對照；同時提高了生姜收獲期葉片的總葉綠素含量、POD和SOD活性。綜合來看，沼澤紅假單胞菌和蘇云金芽孢桿菌融合菌株的促生及生防潛力較親本沼澤紅假單胞菌有所提高，為微生物菌種改良提供了依據(jù)。

關鍵詞：沼澤紅假單胞菌；蘇云金芽孢桿菌；原生質體融合；生姜；根結線蟲

中圖分類號：Q813.2 文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2023）10-0043-07

Constructing a Distant Protoplast Fusion Strain of Rhodopseudomonas palustris and Bacillus thuringiensis to Biocontrol? Ginger Root-Knot Nematodes

KANG Xiao-wen1， DU Xiao-hua2， WANG Dong-wei2， CHENG Ju-e2， WANG Zhong-yong2， SUN Shu-e2， SU Pin2， LIU Yong2

（1. Asset Management Center of Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 2. Hunan Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC）

Abstract：Microbial protoplast fusion breeding is an important direction of microbial strain improvement. Based on the advantages of Rhodopseudomonas palustris PSB-06 for promoting growth and enhancing host resistance， and strong stress resistance of Bacillus thuringiensis KY-1， their fusion strain was obtained by protoplast fusion technology， whose control effect on ginger root-knot nematode disease was tested. The results showed that the fusion strain treatment significantly reduced the number of soil root-knot nematodes， and the disease control effect reached 73.68% in the harvest period. Meanwhile， it significantly improved agronomic traits， yield and quality of ginger; the number of ginger bulb per plant （13.80）， ginger bulb width （33.47 cm） and the yield per plant （1.29 kg） all surpassed the blank control; at the same time， the total chlorophyll content， and POD and SOD activities of ginger in the harvest period were increased. In conclusion， the fusion strain of Rhodopseudomonas palustris and Bacillus thuringiensis has produced much stronger growth promotion and biocontrol effects than the parent strain PSB-06， which may provide theoretical and practical support for the improvement of microbial strains.

Key words：Rhodopseudomonas palustris; Bacillus thuringiensis; protoplast fusion; ginger; root-knot nematode

收稿日期：2023–08–06

基金項目：湖南省自然科學基金青年基金（2022JJ40234）；雜交水稻全國重點實驗室自主研究項目（2023MS03）；湖南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新資金（2023CX18；2022CX1；2022CX84-18）；長沙市自然科學基金（kq2202338）

作者簡介：康霄文（1964—），男，湖南漣源市人，副研究員，主要從事植物病害研究、科技產(chǎn)品推廣、科技服務和資產(chǎn)管理等工作。并列第一作者：杜曉華。

通信作者：蘇 品，劉 勇

近年來，隨著綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展和供給的結構性調整，微生物農(nóng)藥因其廣譜、高效、安全、環(huán)境相容性好等特點受到廣泛關注，其研究和應用已成為植物病蟲害綜合治理的重要手段，同時也是保護生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證[1]。

目前，常用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的微生物農(nóng)藥有蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠色哈茨木霉菌和光合細菌等，主要用于防治作物病害、蟲害以及促進作物生長等[2]。其中，芽孢桿菌是好氧或兼性厭氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿菌的總稱，其生理特征明顯，分布廣泛，是土壤和植物體表或根際的重要微生物種群。芽孢桿菌由于能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，其在環(huán)境中的存活率、定殖率均較高，便于生產(chǎn)和加工成生防菌劑。田間應用研究已經(jīng)證實，芽孢桿菌生防菌劑在穩(wěn)定性、與化學農(nóng)藥的相容性以及在不同植物不同時間防效的一致性等方面表現(xiàn)優(yōu)異。同時，芽孢桿菌作為土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢微生物種群之一，具有很強的拮抗作用和抗逆能力，是植物病害生防微生物的重要組成部分[3-4]。光合細菌是能利用細菌葉綠素進行光合自養(yǎng)型生長的一類微生物總稱，也是植物表面與土壤微生物群落的一個重要組成部分。光合細菌通過自身的特征代謝活動，參與植物的養(yǎng)分攝取、生長發(fā)育、逆境抵御等過程，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中與植物以及其他微生物關系密切的有益微生物。此外，光合細菌還可通過誘導免疫反應等方式維護植物與土壤的健康。作為一類代謝功能多樣、分布廣泛、環(huán)境適應能力強，且與植物生長密切相關的微生物，光合細菌將是新型多功能微生物肥料與微生物農(nóng)藥開發(fā)的重要菌種資源[5]。然而目前，我國利用微生物農(nóng)藥對植物病害進行生物防治往往是以單一的生防因子為原料，導致了微生物農(nóng)藥的抗菌譜狹窄、綜合防效差、需菌量大、環(huán)境依賴性強，同時還存在產(chǎn)品保藏期短和菌種易退化等問題[1]。這對生防微生物農(nóng)藥的研發(fā)和改良提出了新的要求。

現(xiàn)代生物技術的發(fā)展和應用，為微生物菌種的改良提供了契機。其中原生質體融合是通過人工方法將來源于不同遺傳類型親本的原生質體去除細胞壁，實現(xiàn)不同基因組的交換、重組，期望得到結合雙親基因型或產(chǎn)生新基因型的菌種。原生質體融合技術，可以克服自然不親和因子的障礙，不經(jīng)過有性生殖就可得到優(yōu)良品種[6]。近年來，該技術廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、疾病防治等各個領域，是進行遺傳育種研究的一個重要手段，而且該技術在基因定位和基因調控等方面也具有重要的應用價值，因此是生防微生物育種的重要手段[7]。該研究對沼澤紅假單胞菌和蘇云金芽孢桿菌進行原生質體融合，篩選融合菌株，并進行了融合菌株防治生姜根結線蟲的田間試驗，以期探索通過原生質體融合技術克服遠緣雜交不親和的可行性，同時為利用基因重組菌株防治植物病蟲害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）PSB-06和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）KY-1由實驗室分離、鑒定、保存。供試生姜為萊蕪地方品種；生姜線蟲防治試驗在山東濟南市萊蕪區(qū)（117°46'80.47"E，36°36'82.43"N）進行，供試土壤為黏性土壤，肥力中等，連續(xù)多年根結線蟲發(fā)病嚴重。

供試培養(yǎng)基：（1）LB液體培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10 g/L，細菌培養(yǎng)用酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，高壓蒸汽滅菌15 min；（2）LB固體培養(yǎng)基：基礎配方同LB液體培養(yǎng)基，另加細菌培養(yǎng)用瓊脂8 g/L，高壓蒸汽滅菌15 min；（3）LB高滲培養(yǎng)基：基礎配方同LB液體培養(yǎng)基，另加蔗糖0.5 mol/L[8]，高壓蒸汽滅菌15 min；（4）光合細菌液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 0.5 g/L，CH3COONa 0.5 g/L，K2HPO4約1 g/L（根據(jù)實際情況將pH值調到7時的用量為準），F(xiàn)eSO4 0.05 g/L，H3BO4 0.05 g/L，NaMoO4 0.05 g/L，酵母提取物1.5 g/L，高壓蒸汽滅菌30 min；（5）光合細菌固體培養(yǎng)基：基礎配方同光合細菌液體培養(yǎng)基，另加細菌培養(yǎng)用瓊脂13 g/L，高壓蒸汽滅菌30 min；（6）光合細菌高滲液體培養(yǎng)基：基礎配方同光合細菌液體培養(yǎng)基，另加蔗糖0.5 mol/L，高壓蒸汽滅菌15 min；（7）光合細菌軟瓊脂培養(yǎng)基：基礎配方同光合細菌液體培養(yǎng)基，另加細菌培養(yǎng)用瓊脂8 g/L和蔗糖0.5mol/L，高壓蒸汽滅菌15 min后加滅活小牛血清200 ml/L。

主要試劑：（1）1 mol/L Tris-Cl（pH值7.8）：10.34 g Tris-HCl和4.17 g Tris-OH溶解在50 mL蒸餾水中；（2）溶液A：0.10 g MgCl2 和11.98 g蔗糖溶于25 mL雙蒸水中，加入500 μL 1 mol/L的Tris-Cl（pH值7.8），并將體積調節(jié)至50 mL；（3）溶液B：0.05 g MgCl2 和13.69 g蔗糖溶于25 mL雙蒸水中，加入500 μL 1 mol/L的Tris-Cl（pH值7.8），并將體積調節(jié)至50 mL；（4）0.8 mol/L 蔗糖溶液：將13.69 g蔗糖溶解在50 mL雙蒸水中；（5）EDTA（pH值 8.0）：將0.70 g EDTA-2Na溶解到15 mL ddH2O中，終濃度為372.20 g/mol；（6）SMM緩沖液（pH值6.5）：34.23 g蔗糖、0.46 g C4H4O4和0.38 g MgCl2溶解在100 mL雙蒸水中；（7）PEG緩沖液：SMM中包含40%（V/V）PEG6000，10 mmol/L CaCl2和5%（V/V） DMSO；（8）溶菌酶：將0.015 g溶菌酶溶解在3 mL雙蒸水中，終濃度為5 mg/mL；（1）～（7）號溶液過濾除菌，常溫保存，（8）號溶液過濾除菌，? ? ? ?－20℃保存。DnaseI（ThermoFisher），－20℃保存。

主要設備有BX51T-32F01光學顯微鏡（olympus）、Nikon-108電子顯微鏡（nikon）。

1.2 試驗方法

1.2.1 親株菌株的準備 沼澤紅假單胞菌PSB-06的純培養(yǎng)物接種于光合細菌生長培養(yǎng)基中，厭氧光照培養(yǎng)，光照強度1 500 lx，溫度32℃，培養(yǎng)至OD530為0.9～1.0；蘇云金芽孢桿菌KY-1的純培養(yǎng)物接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)到OD600為0.9～1.0。

1.2.2 沼澤紅假單胞菌PSB-06原生質體的制備 原生質體制備方法參考前人[9-11]的方法進行相應修改。取對數(shù)生長期的PSB-06純培養(yǎng)物按1∶10的比例稀釋到30 mL含有終濃度60 μg/mL的頭孢噻肟鈉光合細菌液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.0 h，2 500? ?r/min 4℃離心4 min棄上清，回收菌體。輕輕加入1 mL 0.8 mol/L的蔗糖，孵育1 min，清洗菌體。棄上清液，操作過程中不要干擾到菌體。將150 ?L的1 mol/L Tris-Cl、120 ?L的5 mg/mL溶菌酶和120 ?L的0.125 mol/L EDTA依次加入到單細胞絲中，室溫孵育10 min。向上述溶液中慢慢加入1 mL溶液A，時間要超過1 min，同時用手輕輕旋轉溶液，室溫下孵育4 min。再緩慢加入7 mL 4℃的溶液B，2 500? r/min 4℃離心4 min。小心地除去所有上清，沉淀重懸于1 mL光合細菌高滲培養(yǎng)基中。在10×100倍油鏡下觀察樣品原生質體的形成過程。將一定量菌體稀釋在蒸餾水中裂解原生質體，然后在光合細菌固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋，統(tǒng)計未形成原生質體的菌體產(chǎn)生的菌落，以此計算原生質體的形成效率。

1.2.3 芽孢桿菌KY-1原生質體的制備 將OD600≈1.0的芽孢桿菌菌懸浮液30 mL 5 000 r/min 4℃離心10 min，去上清。將菌體重懸在30 mL SMM緩沖液中，并加入終濃度1 mg/mL的溶菌酶，100 r/min，37℃震蕩培養(yǎng)1 h。5 000 r/min 4℃離心10 min，去上清，沉淀重懸于1 mL LB高滲培養(yǎng)基中。在10×100倍油鏡下觀察原生質體的形成過程。將一定量菌體稀釋在蒸餾水中裂解原生質體，然后在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋，統(tǒng)計未形成原生質體的菌體產(chǎn)生的菌落，以此計算原生質體的形成效率。

1.2.4 原生質體的融合和再生 分別取0.5 mL制備成功的PSB-06和KY-1原生質體，混合后加入1 U的DNaseI來消解因菌體裂解而釋放的DNA，從而防止在原生質體形成過程中因吸收裂解菌體釋放的DNA而產(chǎn)生的轉化。將上述混合液在25℃下孵育10 min，3 500 r/min 4℃離心20 min，重懸在0.5 mL PEG緩沖液中。繼續(xù)在25℃下孵育5～20 min后，加入1 mL SMM緩沖液，3 500 r/min 4℃離心20 min。融合完成后，立即加入5倍體積的SMM緩沖液稀釋、離心、洗滌菌體2次。將菌體重懸在光合細菌高滲液體培養(yǎng)基中，梯度稀釋后涂布于光合細菌軟瓊脂培養(yǎng)基上再生?？寺【w的16S rDNA，測序，以鑒定出融合子，然后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.5 融合菌株防治生姜根結線蟲的田間試驗 試驗設4個處理，分別為：處理1，分別在2020年4月18日（發(fā)芽期）、7月11日（苗期）、9月8日（旺盛期）進行融合菌株（5 kg/667 m2）灌根處理；處理2：分別在2020年4月18日（發(fā)芽期）、7月11日（苗期）、9月8日（旺盛期）進行親株PSB-06（5 kg/667m2）灌根處理；處理3：2019年11月25日至2020年3月3日進行土壤棉隆熏蒸處理，熏蒸液用量為20 kg/667m2；處理4：空白對照，未進行任何消毒處理。每個處理5次重復，小區(qū)面積16 m×0.7 m，隨機區(qū)組排列。采用旋耕整地，生姜種植間距為18～20 cm。每個處理設3條保護線以維持環(huán)境條件的一致性。土壤樣品收集、各處理的根結線蟲防效、生姜生長指標和葉片生理活性指標測定、土壤微生物多樣性及其理化性質分析等均參照Wang等[12]的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Excel、SPSS13.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 融合菌株的獲得

在油鏡下觀察了融合過程，并記錄了原生質體制備各階段的形態(tài)變化，如圖1所示，對親本菌株進行處理后，在10×100倍油鏡下觀察到沼澤紅假單胞菌PSB-06和蘇云金芽孢桿菌KY-1酶解前的形態(tài)（圖1A和C）和外壁剝離后形成的由細胞膜包裹的原生質體形態(tài)（圖1B和D）。視野中大部分菌體的原生質體由于剝離細胞壁后失去細胞剛性，形成由內膜包裹的油煎蛋狀。與酶解前相比幾乎無帶壁菌體的存在，且制備的原生質體數(shù)目充足。圖2顯示了2個原生質體融合后形成融合菌株的形態(tài)。同時，在掃描電鏡下觀察了沼澤紅假單胞菌PSB-06菌體原生質體的形成過程如圖3所示，圖3A所示為沼澤紅假單胞菌PSB-06的菌體形態(tài)，而頭孢噻肟鈉和溶菌酶處理后視野中的菌體外膜已經(jīng)從菌體部分剝離（圖3B）或者不可見，進而形成原生質體（圖3C）。

2.2 融合菌株對生姜根結線蟲的防治效果

如圖4A所示，發(fā)芽期各處理土壤樣品中根結線蟲數(shù)量均較低，但各處理間無顯著差異（P＞0.05）。從苗期到收獲期根結線蟲蟲口數(shù)量逐漸增加，旺盛生長期根結線蟲數(shù)量顯著增加。每100 g土壤中，苗期融合菌株處理的根結線蟲平均蟲口數(shù)為0.60條，PSB-06處理為0.80條，隆棉消毒處理的為0.40條，3個處理的根結線蟲數(shù)量均低于空白對照的2.20條，且差異顯著（P＜0.05）。旺盛生長期和收獲期，融合菌株處理的根結線蟲平均蟲口數(shù)分別為8.20和8.40條，均顯著低于空白對照（P＜0.05），且旺盛生長期融合菌株處理的根結線蟲平均蟲口數(shù)顯著低于PSB-06處理和隆棉消毒處理（P＜0.05）。

如圖4B所示，收獲期融合菌株處理的根結線蟲病情指數(shù)為10，顯著低于空白對照（P＜0.05）。融合菌株處理對根結線蟲的防效達73.68 %，顯著優(yōu)于親本菌株PSB-06處理的47.37 %和隆棉消毒處理的52.36 % （P＜0.05）；且與空白對照相比，生防菌株PSB-06和隆棉消毒處理都能顯著降低生姜根結線蟲的病情指數(shù)，減輕根結線蟲對生姜的危害，且防效持續(xù)性較好。

2.3 融合菌株對生姜生長指標的影響

如表1所示，與空白對照相比，收獲期各處理對生姜的株高、分蘗數(shù)、主莖粗、主莖葉數(shù)、單株姜球數(shù)、姜球寬度和單株產(chǎn)量均具有一定的促進作用，其中以融合菌株處理的效果最好，生姜株高達110.60 cm、分蘗數(shù)為11.10個、主莖粗達5.39 cm，均顯著高于對照的（P＜0.05），但各處理對主莖葉數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。與空白對照相比，融合菌株處理顯著提高了生姜的產(chǎn)量和品質，融合菌株處理單株姜球數(shù)達13.80個、姜球寬度達33.47 cm，單株產(chǎn)量達1.29 kg，均顯著優(yōu)于空白對照處理 （P＜0.05）。

2.4 融合菌株對生姜葉片的總葉綠素含量和抗脅迫能力的影響

由圖5可知，融合菌株處理生姜葉片在苗期和收獲期的總葉綠素含量分別為2.04和1.91 mg/g，均顯著高于空白對照的1.45和1.13 mg/g（P＜0.05），旺盛生長期各處理生姜葉片的總葉綠素含量差異不顯著。收獲期融合菌株處理的生姜葉片總葉綠素含量顯著高于親本菌株PSB-06處理和隆棉消毒處理 （P＜0.05）。

由圖6可知，苗期和旺盛生長期，各處理生姜葉片的POD活性無顯著差異（P＞0.05），收獲期融合菌株處理的生姜葉片POD活性為16.10 U/g，顯著高于其他處理（圖6A）；SOD活性方面，旺盛生長期各處理葉片中SOD活性差異不顯著，苗期和收獲期融合菌株處理生姜葉片SOD活性分別為100.37、116.59 U/g，均顯著高于空白對照（P＜0.05）（圖6B）。

3 討 論

微生物原生質體融合育種技術為跨界融合理論提供了現(xiàn)實依據(jù)，在得到雜種細胞的同時保持了親本遺傳物質的穩(wěn)定傳遞[13]。但原生質體融合技術作為品系改良策略仍有一個缺點，就是許多雜交菌株

有絲分裂不穩(wěn)定，染色體丟失（導致非整倍體）或分離到親本品系的情況經(jīng)常發(fā)生[6]。同樣，實驗室中的融合菌株在傳代培養(yǎng)時也會發(fā)生一方親本遺傳物質丟失的情況，這有待進一步的研究和改良。

沼澤紅假單胞菌PSB-06原生質體的制備在實驗室原有方法的基礎上做了相應改進，形成了“混合酶破壁加化學誘導法”去除菌體細胞壁。頭孢噻肟鈉通過抑制轉肽酶的合成初步抑制菌體細胞壁的合成以形成單細胞絲，然后EDTA處理以除去部分外壁，最后用溶菌酶消化暴露的肽聚糖。原生質體融合和再生試驗中，筆者發(fā)現(xiàn)雖然沼澤紅假單胞菌和蘇云金芽孢桿菌的最適生長溫度均不是25～28℃，但融合子在25～28℃下的再生率略高于30℃（沼澤紅假單胞菌PSB-06的最適生長溫度）時的再生率；同時，融合子混合于融化的45℃軟瓊脂培養(yǎng)基時的再生率低于直接將融合子涂布于含0.5 mol/L蔗糖的軟瓊脂培養(yǎng)基時的再生率，且含有部分外壁的原生質體再生率較高，因此原生質體融合時不需要去掉全部細胞壁來達到融合的目的。

融合菌株防治生姜根結線蟲的試驗結果表明，融合菌株對生姜根結線蟲有較好的防治效果。在生姜發(fā)芽期和苗期，土壤中的根結線蟲數(shù)量較少，在旺盛生長期和收獲期顯著增加。很有可能是生姜生長早期氣溫過低，根結線蟲的繁殖速度慢所致。后期隨著環(huán)境溫度的升高，根結線蟲種群規(guī)模迅速增加。與空白對照相比，融合菌株對根結線蟲的防治效果可一直持續(xù)到收獲期，且融合菌株對根結線蟲的防治效果優(yōu)于親本菌株PSB-06（融合菌株與另一親本蘇云金芽孢桿菌KY-1抗脅迫能力的比較尚在試驗中）。從生姜收獲期的生長指標來看，融合菌株顯著提高了生姜地上部分的農(nóng)藝性狀及生姜的品質和產(chǎn)量，而且融合菌株提高了苗期和收獲期生姜葉片的葉綠素含量，筆者推測，融合菌株很有可能通過提高葉綠素的含量來增強生姜植株的光合作用，從而提高生姜的產(chǎn)量和品質，且前人的研究也顯示親本菌株PSB-06具有促進植物生長的作用[14-15]。從生姜葉片的抗氧化活性來看，在生長發(fā)育早期各處理生姜葉片的POD活性差異不顯著，收獲期融合菌株處理生姜葉片的POD活性顯著高于空白對照；融合菌株處理在苗期和收獲期顯著提高了生姜葉片的SOD活性，且在收獲期SOD活性顯著高于親本菌株PSB-06處理。已有報道顯示，在脅迫條件下或植物生長后期，POD和SOD活性均有所升高[16]。這表明融合菌株處理增強了生姜的耐脅迫能力，也預示著微生物原生質體融合菌株在防治植物病蟲害、提高植物抗脅迫能力等方面具有一定的潛力。

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（責任編輯：成 平）