葉鑫，王夢涵，袁婉婧，胡凡，曾宏亮，謝彪?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410031）

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其早期特異性癥狀不明顯，發(fā)生和發(fā)展極其隱蔽，因此大部分結(jié)直腸癌被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是中晚期。此時，腫瘤細(xì)胞已轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官，預(yù)后差，治愈率低，是導(dǎo)致結(jié)直腸癌病死率居高不下的重要原因之一［1］。手術(shù)及長期放化療依然是大多數(shù)結(jié)直腸癌患者的首選治療方案，但其預(yù)后效果略有不足，尤其是針對轉(zhuǎn)移性病變的患者。研究表明，轉(zhuǎn)移性病變的患者五年生存率僅約12%，生存率是未轉(zhuǎn)移患者的50%［2］。

中醫(yī)藥治療強(qiáng)調(diào)治病求本，扶正祛邪，注重防治，臨床常用健脾補(bǔ)腎之法，養(yǎng)先后天之本，扶正氣以御邪，同時促進(jìn)脾的運(yùn)化功能和腎的氣化功能，有助于津液的代謝和血液的化生，以祛瘀之法祛除“痰”“瘀”等結(jié)直腸癌病理產(chǎn)物，瘀血去則新血生，從而使人體的病理狀態(tài)趨于正常。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著不可忽視的作用［3］，而波形纖維蛋白（Vimentin）是EMT的標(biāo)志蛋白，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移，在多種上皮來源的惡性腫瘤中均顯示高表達(dá)。E黏鈣蛋白（E-cadherin）可以增強(qiáng)細(xì)胞黏附力，高表達(dá)時可以抑制腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，是公認(rèn)的抑癌因子，其表達(dá)缺失是EMT的發(fā)生標(biāo)志［4-5］。

血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）是近來發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因子，血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR-3）是VEGF-C其中一個重要受體，其在人體各組織中均有表達(dá)，但在腫瘤發(fā)生時，VEGFR-3在許多腫瘤組織中處于過表達(dá)的狀態(tài)［6-7］。

因此，本實(shí)驗(yàn)以裸鼠成瘤模型為研究對象，通過免疫組化法檢測裸鼠瘤體組織中VEGF-C、VEGFR-3、Vimentin及E-cadherin的表達(dá)情況，探討健脾補(bǔ)腎法對結(jié)直腸癌移植瘤組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

16只SPF級裸鼠，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動物實(shí)驗(yàn)中心的獨(dú)立通氣籠盒內(nèi)，溫度24 ℃，濕度40%～50%，白晝交替。動物質(zhì)量合格證：430727201101778068，許可證號：SCXK2019-0004。本次實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物與試劑

健脾補(bǔ)腎中藥復(fù)方組方：人參15 g，黃芪20 g，砂仁5 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，陳皮6 g，半夏9 g，山藥20 g，女貞子10 g，墨旱蓮10 g，菟絲子10 g，枸杞子10 g，雞血藤10 g，白花蛇舌草2 g，三七3 g，半枝蓮15 g，甘草5 g；其配方顆粒購買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院。VEGF-C、VEGFR-3抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：Al10188078、BB09192758）；E-cadherin、Vimentin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：00113481、00110734）；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，HCT116）。

1.3 主要儀器

顯微鏡（奧林巴斯 BX53）；石蠟切片機(jī)（YB-8LF）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2245）；自動組織脫水機(jī)（HP300）；生物組織攤烤片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司YT-7F型）；細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）。

1.4 建模、分組及給藥

取HCT116人結(jié)直腸癌細(xì)胞株150 μL（約含細(xì)胞1 × 107個）接種于已自適應(yīng)1周的裸鼠右腿內(nèi)側(cè)構(gòu)建結(jié)直腸癌移植瘤模型。在籠中飼養(yǎng)14 d后，將16只造模后的裸鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組兩組。裸鼠建模成功后首次灌胃時間記為第1天。對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液0.4 mL/d ，實(shí)驗(yàn)組灌胃健脾補(bǔ)腎中藥復(fù)方23.4 g/kg，兩組均隔天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.5 取材

灌胃第15天脫頸處死裸鼠，剝離瘤體，眼科剪將其剪成兩部分，一部分常規(guī)制作石蠟組織切片，另一部分放入-80 ℃冰箱凍存。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

將包埋好的腫瘤組織經(jīng)流水沖洗后用蒸餾水浸泡5 min；切片置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15 min、流水沖洗；而后浸泡于3%過氧化氫溶液20 min、PBS沖洗三次；封閉滅活內(nèi)源性過氧化酶后分別加 VEGF-C、VEGFR-3、E-cadherin、Vimentin等一抗（1∶100體積比稀釋），置入4 ℃冰箱過夜，室溫復(fù)溫后加二抗（1∶500體積比稀釋）室溫放置30 min、PBS沖洗3次；DAB 顯色、蘇木精復(fù)染；脫水、透明、封片。本研究由病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片。

VEGF-C、VEGFR-3、E-cadherin及Vimentin顯示胞質(zhì)及胞膜陽性（有黃色或棕褐色顆粒）。計算陽性細(xì)胞數(shù)比率，＜ 5%的細(xì)胞陽性著色為0分；6%～25%的細(xì)胞陽性著色為1分；26%～50%的細(xì)胞陽性著色為2分；51%～75%的細(xì)胞陽性著色為3分；＞ 75%的細(xì)胞陽性著色為4分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠移植瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3免疫組化表達(dá)情況比較

VEGF-C、VEGFR-3在對照組中均呈現(xiàn)高表達(dá)，經(jīng)健脾補(bǔ)腎中藥復(fù)方干預(yù)后，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中VEGF-C和VEGFR-3的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05）。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 兩組腫瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3的表達(dá)（× 40）

表1 兩組移植瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)情況比較（±s）

表1 兩組移植瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05。

VEGFR-3 2.42±0.53 0.28±0.49*組別對照組實(shí)驗(yàn)組n8 8 VEGF-C 2.00±0.82 0.14±0.38*

2.2 兩組裸鼠移植瘤組織中Vimentin、E-cadherin免疫組化表達(dá)情況比較

Vimentin在對照組中呈現(xiàn)高表達(dá)，E-cadherin呈現(xiàn)低表達(dá)，經(jīng)健脾補(bǔ)腎中藥復(fù)方干預(yù)后，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中Vimentin表達(dá)明顯下調(diào)，Ecadherin表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表2。

圖2 兩組腫瘤組織中Vimentin、E-cadherin的表達(dá)（× 40）

表2 兩組移植瘤組織中Vimentin、E-cadherin表達(dá)情況比較（±s）

表2 兩組移植瘤組織中Vimentin、E-cadherin表達(dá)情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與對照組比較，**P ＜ 0.05。

組別對照組實(shí)驗(yàn)組E-cadherin 1.43±0.98 2.57±0.53**n8 8 Vimentin 2.29±0.76 0.14±0.38*

3 討論

健脾補(bǔ)腎法是通過應(yīng)用六君子湯合二至丸加減解毒祛瘀類中藥而實(shí)現(xiàn)，前期研究已表明本法可明顯抑制人結(jié)直腸癌移植瘤的增殖［8］。健脾補(bǔ)腎中藥復(fù)方中人參健脾補(bǔ)氣、益腎氣助腎陽，黃芪扶正祛邪、健脾益氣，二者合而為君；茯苓、山藥健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰，白術(shù)、茯苓健脾滲濕，女貞子、墨旱蓮益腎滋陰，菟絲子、枸杞子補(bǔ)腎填精為臣；氣虛易滯，砂仁化濕開胃以助行氣，陳皮理氣健脾，氣為血之帥，氣虛則血瘀滯于內(nèi)，三七、雞血藤活血化瘀，脾失運(yùn)化，痰瘀阻于內(nèi)，半夏燥濕化痰，共為佐藥；再以清熱解毒的白花蛇舌草、半枝蓮，健脾益氣，調(diào)和諸藥的甘草為佐使。全方應(yīng)用補(bǔ)氣藥、補(bǔ)陰藥，加以兩味清熱解毒藥，伍以活血、化痰、滲濕、理氣藥，共奏健脾益氣、補(bǔ)腎固本、活血行氣、化瘀解毒之功效。人參中的主要成分人參皂苷Rb2具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的作用，人參皂苷Rb3則能夠抑制血管生成起到抑癌作用［9-10］。甘草中的甘草黃素能明顯抑制轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT［11］。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明健脾補(bǔ)腎法可能對人結(jié)直腸癌組織的轉(zhuǎn)移具有抑制作用。

目前針對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療主要采用靶向藥物［12］，其中代表便是表皮生長因子（EGFR）靶向藥物及血管內(nèi)皮生長因子靶向藥物，盡管該治療方法顯示出了較好的治療效果，但是患者個體的耐藥性及此類藥物有嚴(yán)格的適用人群等依然是限制其應(yīng)用的首要問題［13-14］。腫瘤發(fā)展的過程中，E-cadherin的缺失抑或是Vimentin表達(dá)升高都能提示EMT的發(fā)生，諸多研究顯示，結(jié)直腸癌的組織學(xué)分級、分化程度及臨床分期與E-cadherin的低表達(dá)密切相關(guān)［15］，而Vimentin在分化程度低的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于中-高分化腺癌組織［16］，因此作為EMT標(biāo)志物的E-cadherin與Vimentin具有成為預(yù)測結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的潛在新靶點(diǎn)的潛力。本次研究結(jié)果表明，健脾補(bǔ)腎法可下調(diào)人結(jié)直腸癌裸鼠組織中VEGF-C、VEGFR-3、Vimentin的表達(dá)同時上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下一步或許可以通過研究健脾補(bǔ)腎法來進(jìn)一步探索結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

有研究表明，VEGFR-3與VEGF-C特異性結(jié)合后，可降低內(nèi)皮細(xì)胞間黏附力，增加淋巴管通透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［17］，VEGF-C/VEGFR-3信號通路是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中促進(jìn)腫瘤淋巴管生成和轉(zhuǎn)移的重要信號傳導(dǎo)途徑［18］，乳腺癌中VEGF-C是非EMT細(xì)胞轉(zhuǎn)化為EMT細(xì)胞的重要介質(zhì)［19］。因此，可以推測運(yùn)用健脾補(bǔ)腎法在人結(jié)直腸癌裸鼠組織中可能通過抑制VEGF-C/VEGFR-3信號通路的激活而降低Vimentin的表達(dá)或提高E-cadherin表達(dá)進(jìn)而抑制EMT的發(fā)生，達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。

4 結(jié)論

綜上所述，健脾補(bǔ)腎法通過下調(diào)人結(jié)直腸癌裸鼠組織VEGF-C、VEGFR-3、Vimentin的表達(dá)同時上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，說明健脾補(bǔ)腎法能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到抗腫瘤的效果，可能是通過抑制EMT轉(zhuǎn)化發(fā)揮作用，但其具體途徑及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。