劉甜甜，馬春雷，劉付紅，郭平?

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

缺血性腦卒中又稱腦梗死，是目前中老年人群常見(jiàn)病、多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率、致死率居高不下，嚴(yán)重威脅人類生命和健康［1-2］。目前臨床治療缺血性腦卒中以溶栓、抗凝、抗血小板、降纖和血栓切除術(shù)等為主，從而恢復(fù)腦組織血流再灌注［3-4］。然而，由于腦部毛細(xì)血管致密，微血管內(nèi)細(xì)胞附壁及微血栓形成，與免疫炎癥反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)造成再灌注無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，反而加劇了缺血性腦損傷［5-7］。再灌注后無(wú)復(fù)流是指通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)大動(dòng)脈再通后，局部組織仍得不到充分血液灌注的現(xiàn)象，這成為外科治療腦梗死，減輕中風(fēng)后遺癥的重要障礙，重視改善再灌注后無(wú)復(fù)流現(xiàn)象是提高再灌注療效的重要方式［8］。

腦梗死屬中風(fēng)病的范疇，缺血性中風(fēng)病是由正氣虧虛、飲食不節(jié)、起居勞倦、情志內(nèi)傷等多種因素，產(chǎn)生風(fēng)、火、痰、瘀等引起腦脈痹阻，臨床以猝然昏仆、不省人事、口歪言謇、半身不遂等為主要表現(xiàn)的病癥。其中，風(fēng)、痰、瘀是影響缺血性中風(fēng)的關(guān)鍵因素，治療宜以祛風(fēng)化痰、活血通絡(luò)為基本治法。痰瘀互結(jié)因于津血同源，與血管內(nèi)皮損傷、血液黏度增加、過(guò)度凝血、神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)關(guān)系密切［9-10］?；低ńj(luò)湯（Huatan Tongluo Decoction，HTTLD）具有熄風(fēng)化痰、活血通絡(luò)的功效。本研究通過(guò)建立小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（MCAO/R）模型，探討化痰通絡(luò)湯對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療作用及機(jī)制，以期為化痰通絡(luò)湯臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，品系C57BL/6J，雄性，8～12周齡，體質(zhì)量22～25 g。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（魯）20180009，小鼠在千佛山醫(yī)院動(dòng)物研究中心SPF級(jí)條件飼養(yǎng)，室溫21～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食飲水，自動(dòng)光照系統(tǒng)模擬晝夜循環(huán)光照12 h/d。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物處置的內(nèi)容均經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。

1.2 主要儀器

解剖顯微鏡（日本OLYMPUS，型號(hào)：SZX2-TR30）；MCAO/R線栓（深圳RWD）；全自動(dòng)真空脫水機(jī)（德國(guó)徠卡，型號(hào)：APS200S）；生物組織包埋機(jī)（浙江科迪，型號(hào)：KD-BM/BL）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡，型號(hào)：RM2235）；攤片烤片機(jī)（浙江科迪，型號(hào)：KD-P）；顯微鏡（日本OLYMPUS，型號(hào)：BX51T）；高速低溫組織研磨儀（武漢Servicebio）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf，型號(hào)：5424R）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermofisher Multiska）；蛋白電泳印記系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)，MINI）；冰凍切片機(jī)（德國(guó)徠卡，型號(hào)：CM1950）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡，型號(hào)：DMi8）。

1.3 主要試劑與藥物

2%TTC染液（Solarbio，批號(hào)：20220113）；蘇木素-伊紅染液（Servicebio，批號(hào)分別是ZH190905、ZH202812）；vWF多抗、Fibrinogen α鏈多抗、GP Ⅸ多抗、β-actin單抗（Proteintech，批號(hào)分別為27186-1-AP、20645-1-AP、14564-1-AP、66009-1-1 g）；Claudin-5多抗（Abcam，批號(hào)：ab15106）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（Jackson，批號(hào)：111-036-003）；HRP標(biāo)記抗小鼠IgG二抗（Cell Signaling Technology，批號(hào)：7076P2）；488山羊抗兔熒光二抗、546猴抗兔熒光二抗（Invitrogen，批號(hào)：A11034、A10040）；DAPI溶液（Solarbio，批號(hào)：C0065）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Thermo，批號(hào)：UJ290653）；WB-HRP發(fā)光液（美國(guó)Millipore，批號(hào)：2205202）；中藥飲片（由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供）；阿司匹林腸溶片（沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20065051）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物組成及制備

化痰通絡(luò)湯組成：白術(shù)9 g，茯苓9 g，半夏9 g，天麻12 g，膽南星6 g，天竺黃6 g，制香附9 g，赤芍9 g，紅花9 g，炒桃仁9 g，紫丹參15 g，大黃6 g及三七（沖服）6 g。將中藥飲片加入8倍量水浸泡，煎煮45 min，過(guò)濾，水煎液濃縮至含生藥量2 g/mL，加入三七粉0.11 g/mL，混勻，藥液含生藥量為2.11 g/mL為高劑量組給藥藥液；中、低劑量組分別加1倍、3倍生理鹽水稀釋。

阿司匹林腸溶片（Aspirin Enteric-coated Tablets，AECT）研磨成極細(xì)粉末，加生理鹽水成0.93 mg/mL藥液。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

85只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Control）10只和造模組75只；模型制作成功小鼠隨機(jī)分為模型組（Model）、化痰通絡(luò)湯高劑量組（HTTLD-H）、化痰通絡(luò)湯中劑量組（HTTLD-M）、化痰通絡(luò)湯低劑量組（HTTLD-L）和阿司匹林腸溶片組（AECT），每組15只。

化痰通絡(luò)湯高、中、低劑量組每日給藥劑量分別為29.64、14.82、7.41 g/kg；阿司匹林腸溶片組每日給藥劑量為13 mg/kg；假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。于再灌注后30 min分別灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥7 d。

2.3 小鼠MCAO/R模型制備及神經(jīng)功能缺損評(píng)分

運(yùn)用Longa法［11］，參照Uluc大鼠MCAO/R模型制作方法［12］，并根據(jù)小鼠解剖特點(diǎn)進(jìn)行改良復(fù)制小鼠MCAO/R模型。小鼠術(shù)前自由進(jìn)食飲水，整個(gè)造模過(guò)程需在解剖顯微鏡下操作。小鼠經(jīng)麻醉消毒后，逐步分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，自左側(cè)頸外動(dòng)脈進(jìn)栓，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈至左側(cè)MCA分叉處，手下會(huì)感到輕微阻力，鏡下會(huì)看到線栓有輕微回彈，輕彈幾次刺激血管收縮利于阻塞成功，進(jìn)栓深度約0.9～1 cm，缺血90 min后拔出線栓再灌注，并縫合傷口。假手術(shù)組僅暴露血管不插入線栓。具體流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠MCAO/R模型制作流程圖

神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，提尾時(shí)右前肢不能完全伸展；2分，爬行時(shí)轉(zhuǎn)圈；3分，右側(cè)前、后肢均不能完全伸展，爬行時(shí)身體向右側(cè)傾倒；4分，右側(cè)癱瘓，無(wú)自發(fā)活動(dòng)或有意識(shí)障礙。評(píng)分1～3分為模型制作成功。

2.4 TTC染色法檢測(cè)腦組織梗死體積

于術(shù)后第8天麻醉小鼠并斷頭取腦組織，-20 ℃速凍20 min，在冰盒上自額葉前極起切出平均厚度約1 mm的5片冠狀切片，放入2% TTC染液中，37 ℃避光水浴20 min，4%多聚甲醛固定，將固定好的腦片按順序排列，并拍照。用ImageJ軟件計(jì)算每片腦組織面積及缺血部位腦組織面積。

缺血區(qū)體積比（%） = 各切片白色缺血區(qū)域面積之和/各腦片面積之和 × 100%

2.5 HE染色法進(jìn)行病理組織形態(tài)檢測(cè)

用PBS緩沖液20 mL，4%多聚甲醛20 mL進(jìn)行組織灌注后取腦組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h。腦組織經(jīng)脫水機(jī)固定程序脫水，經(jīng)包蠟、切片、脫蠟、HE染色、脫水、封片后，顯微鏡觀察并拍照。

2.6 Western blot檢測(cè)腦組織中vWF、Fibrinogen、Claudin-5和Occludin蛋白表達(dá)

選擇左側(cè)半暗帶部位腦組織，經(jīng)裂解液（RIPA∶PMSF = 100∶1）裂解15 min；研磨、離心后取上清；用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按蛋白樣品：5 × Bufer = 4∶1比例向蛋白質(zhì)樣品中加入5 × Bufer，95 ℃加熱15 min使蛋白質(zhì)變性。取蛋白樣品50 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉2 h，加入一抗（vWF、Fibrinogen、Claudin 5、Occludin抗體∶一抗稀釋液=1∶1 000；β-actin抗體∶一抗稀釋液=1∶5 000） 4 ℃孵育過(guò)夜。次日經(jīng)TBST洗，加入相應(yīng)二抗（1∶8 000）孵育2 h，TBST洗膜后顯影。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.7 免疫熒光檢測(cè)腦組織vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen、Claudin-5和Occludin表達(dá)

腦組織OCT包埋，切取7 μm冰凍切片，PBS清洗，按Triton∶PBS = 1∶1 000比例透膜10 min，PBS清洗，5%胎牛血清封閉液封閉30 min，加一抗（vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen、Claudin-5、Occludin抗體∶PBS=1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBS洗去一抗。加入二抗（vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen用488羊抗兔熒光二抗，Claudin-5、Occludin用546 猴抗兔熒光二抗，二抗∶PBS = 1∶300）避光孵育2 h，PBS洗后加DAPI 10 min，PBS洗后用抗熒光衰減封片劑封片，于熒光顯微鏡下拍照。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，滿足方差齊性，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD post hoc）檢驗(yàn)，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)均 ≥ 3次。

3 結(jié)果

3.1 小鼠死亡情況

術(shù)后7 d內(nèi)，假手術(shù)組小鼠沒(méi)有死亡，模型組死2只，化痰通絡(luò)湯高、中劑量組各死亡1只，化痰通絡(luò)湯低劑量組死亡2只，阿司匹林腸溶片組死亡4只。

3.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

于術(shù)后第8天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組小鼠出現(xiàn)顯著神經(jīng)功能缺損（P＜0.01）；與模型組比較，化痰通絡(luò)湯高、中、低劑量組和阿司匹林腸溶片組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）；其中化痰通絡(luò)湯中劑量組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分最低，但各給藥組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織梗死體積比較（±s）

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織梗死體積比較（±s）

注：與Control比較，**P ＜ 0.01；與Model比較，##P ＜ 0.01，#P ＜0.05。

梗死體積比/%0 29.10±0.51**16.35±1.29##13.11±0.93##15.85±1.05##15.61±1.34##組別Control Model HTTLD-H HTTLD-M HTTLD-L AECT n3 3 3 3 3 3神經(jīng)功能缺損評(píng)分/分0 1.77±0.17**1.29±0.13##1.21±0.11##1.38±0.14#1.30±0.15#

3.3 TTC染色結(jié)果

假手術(shù)組小鼠腦組織無(wú)明顯白色梗死灶，模型組與各模型加藥物組小鼠腦組織均有明顯白色梗死灶。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織梗死體積顯著增加（P＜ 0.01）；與模型組比較，化痰通絡(luò)湯高、中、低劑量組和阿司匹林腸溶片組小鼠腦組織梗死體積均顯著減小（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 腦組織TTC染色圖

3.4 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組小鼠腦組織可見(jiàn)密布血管網(wǎng)，且血管清晰、分布均勻；細(xì)胞完整，排列整齊有序，胞質(zhì)均勻，核仁清晰可見(jiàn)。模型組小鼠腦組織鮮有完整血管存在、管腔內(nèi)斑塊阻塞微血管；細(xì)胞排列紊亂、胞膜碎裂，胞核固縮、變形，呈現(xiàn)出明顯壞死改變。各給藥組小鼠腦組織均有血管網(wǎng)分布，其中化痰通絡(luò)湯高、中劑量組血管網(wǎng)較為清晰，管內(nèi)有少量細(xì)胞沉積；多數(shù)細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)均勻，胞體完整，核仁清晰。化痰通絡(luò)湯低劑量組和阿司匹林腸溶片相較于模型組，血管相對(duì)清晰，但仍有明顯斑塊沉積，血管閉塞情況有所改善。見(jiàn)圖3。

圖3 腦組織HE染色圖（× 400）

3.5 Western blot結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中vWF、Fibrinogen蛋白表達(dá)顯著升高（P＜ 0.01），Claudin-5、Occludin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜ 0.01）。與模型組比較，化痰通絡(luò)湯高、中劑量組與阿司匹林腸溶片組vWF和Fibrinogen表達(dá)顯著降低（P＜ 0.01）；化痰通絡(luò)湯低劑量組vWF表達(dá)顯著降低（P＜ 0.01），F(xiàn)ibrinogen表達(dá)降低不顯著（P＞ 0.05）；化痰通絡(luò)湯中劑量組Claudin-5蛋白表達(dá)顯著升高（P＜ 0.01），化痰通絡(luò)湯高、低劑量組Claudin-5蛋白表達(dá)雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；化痰通絡(luò)湯高、低劑量組Occludin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05），化痰通絡(luò)湯中劑量組與阿司匹林腸溶片組Occludin蛋白表達(dá)雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)圖4和表2。

表2 各組小鼠腦組織Western blot相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組小鼠腦組織Western blot相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與Control比較，**P ＜ 0.01；與Model比較，##P ＜ 0.05，#P ＜ 0.01；與AECT比較，▲▲P ＜ 0.01。

組別Control Model HTTLD-H HTTLD-M HTTLD-L AECT Occludin/β-actin 1.12±0.01 0.59±0.00**1.08±0.03#1.03±0.07 1.20±0.27#0.97±0.24 n3 3 3 3 3 3 vWF/β-actin 0.49±0.07 0.87±0.05**0.53±0.05##0.39±0.05##0.38±0.07##0.42±0.1##Fibrinogen/β-actin 0.27±0.02 1.01±0.05**0.49±0.11##0.59±0.11##0.96±0.04▲▲0.44±0.07##Claudin-5/β-actin 1.53±0.11 0.69±0.05**0.88±0.05 1.25±0.12##▲▲0.86±0.13 0.53±0.19

圖4 Western blot結(jié)果

3.6 免疫熒光結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中vWF、GPⅨ、Fibrinogen表達(dá)顯著增加（P＜ 0.01），Claudin-5和Occludin表達(dá)顯著降低（P＜ 0.01）；與模型組比較，化痰通絡(luò)湯高、中、低劑量組和阿司匹林腸溶片組vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen表達(dá)顯著降低（P＜ 0.01），Claudin-5表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；化痰通絡(luò)湯高、中、低劑量組Occludin表達(dá)顯著升高（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖5～9和表3。

表3 各組小鼠腦組織熒光表達(dá)量比較（±s，%）

表3 各組小鼠腦組織熒光表達(dá)量比較（±s，%）

注：與Control比較，**P ＜ 0.01；與Model比較，##P ＜ 0.05，#P ＜ 0.01；與AECT比較，▲▲P ＜ 0.01。

Occludin 2.60±0.17 0.63±0.07**2.51±0.13##▲▲2.24±0.13##▲▲2.05±0.12##▲▲0.97±0.09組別Control Model HTTLD-H HTTLD-M HTTLD-L AECT n4 4 4 4 4 4 vWF 0.27±0.02 5.56±0.36**0.43±0.05##▲▲0.82±0.22##▲▲3.21±0.16##2.77±0.25##GP9 1.33±0.10 2.79±0.22**0.29±0.04##▲▲0.29±0.03##▲▲1.25±0.06##1.28±0.27##Fibrinogen 0.34±0.03 5.54±0.61**0.42±0.04##0.62±0.12##1.76±0.23##1.09±0.09##Claudin-5 3.25±0.49 0.21±0.05**1.08±0.07#1.44±0.13##1.37±0.15##1.68±0.10##

圖5 vWF免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖6 GPIX免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖7 Fibrinogen免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖8 Claudin-5免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖9 Occludin免疫熒光結(jié)果（× 200）

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，vWF和GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物介導(dǎo)的血小板早期黏附在缺血性腦卒中血栓炎癥反應(yīng)和再灌注無(wú)復(fù)流現(xiàn)象中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［7］。vWF是一種大的多聚體糖蛋白，主要在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞內(nèi)合成，然后被分泌到血液或存儲(chǔ)到內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體和血小板α顆粒。血小板膜糖蛋白GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物是血小板表面黏附受體，在缺血性腦卒中的病理過(guò)程中，vWF通過(guò)與血小板膜糖蛋白GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物結(jié)合，刺激血小板黏附和下游活化信號(hào)激活血小板，并結(jié)合激活整合素GP Ⅱb/Ⅲa，刺激血小板聚集［13-16］；vWF與結(jié)合活化的血小板在缺血性腦卒中病理過(guò)程中通過(guò)各種黏附分子的相互作用，募集白細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等并進(jìn)一步刺激微血栓形成阻塞微血管［7，17］。研究指出，抑制vWF聚集［17-18］，或抑制血小板膜糖蛋白 Ⅰb（glycoprotein Ⅰb，GP Ⅰb）［19］，或阻斷vWF與GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物相互作用［20］，減少血小板早期黏附可明顯減少中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞募集，維護(hù)血腦屏障［21-24］，減少微血栓的形成和纖維蛋白原沉積，改善微循環(huán)阻塞，發(fā)揮抗血栓形成、減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷。

血腦屏障是介于血液與腦組織之間的重要屏障，能夠限制有潛在毒性的血漿成分、血細(xì)胞和病原體等進(jìn)入腦組織，發(fā)揮維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的作用。血腦屏障主要由兩部分組成，一是由腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障；二是由脈絡(luò)叢形成的血漿與腦脊液之間的屏障。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接、黏附連接和間隙連接蛋白連接，在緊密連接中Occludin、Claudins和黏附分子形成對(duì)液體不可滲透的屏障［25］。Occludin和Claudin-5是最具代表性的緊密連接蛋白，在腦毛細(xì)血管高表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性發(fā)揮維持血管穩(wěn)態(tài)的作用［26］。腦缺血誘導(dǎo)Occludin降解和Claudin-5表達(dá)減少，促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而增加再灌注后出血的可能［27-28］。因此，維持Occludin和Claudin-5表達(dá)，維護(hù)血腦屏障完整性對(duì)減少再灌注后腦出血至關(guān)重要。因本研究所用化痰通絡(luò)湯活血化瘀之力較強(qiáng)，恐有損傷血脈之弊，故而同時(shí)研究其對(duì)血腦屏障緊密連接蛋白Claudin-5和Occludin的調(diào)節(jié)作用。

化痰通絡(luò)湯適用于缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)之風(fēng)痰阻絡(luò)證，主方由半夏、生白術(shù)、天麻、茯苓、膽南星、天竺黃、紫丹參、香附、酒大黃、三七組成，本實(shí)驗(yàn)所用化痰通絡(luò)湯參照臨床應(yīng)用在原方基礎(chǔ)上加用桃仁、紅花、赤芍以增強(qiáng)活血化瘀之力［29］。方中半夏燥濕化痰，天麻平肝潛陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)為君藥；丹參、桃仁、紅花、赤芍涼血化瘀，活血而不致血熱妄行為臣藥；白術(shù)、茯苓健脾利濕，膽南星、天竺黃有清熱化痰之效，共奏理氣健脾、燥濕化痰、熄風(fēng)止痙之功，香附理氣和中，兼三七止血活血共為佐藥；酒大黃通腑泄?jié)?，蕩滌腸胃，使腑氣通而痰濁得化。綜觀全方，溫涼并用，活血與化痰兼顧，共奏活血祛瘀、化痰通絡(luò)之功。

降低病死率和致殘率是中風(fēng)病治療的首要目標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，小鼠MCAO/R后，腦組織梗死灶明顯，神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯缺損?；低ńj(luò)湯高、中劑量能夠減少M(fèi)CAO/R小鼠病死率，高、中、低劑量均可減少腦組織梗死體積，改善神經(jīng)功能，以中劑量組效果最佳。HE染色結(jié)果顯示，化痰通絡(luò)湯中劑量組較好地維持了血管壁的完整性，血管中細(xì)胞沉積較少。Western blot和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，化痰通絡(luò)湯可減少M(fèi)CAO/R小鼠腦組織中vWF、GP Ⅸ和Fibrinogen蛋白表達(dá)，同時(shí)升高Claudin-5和Occludin蛋白表達(dá)，在抗血小板、降聚、降纖的同時(shí)，在一定程度上維護(hù)血腦屏障。

綜上所述，化痰通絡(luò)湯可減少腦缺血再灌注小鼠腦組織梗死體積，改善神經(jīng)功能，其作用可能與化痰通絡(luò)湯能降低缺血再灌注后腦組織中vWF表達(dá)，減少血小板黏附和聚集，減少纖維蛋白原沉積，同時(shí)升高Claudin-5和Occludin蛋白表達(dá)，維護(hù)血腦屏障有關(guān)。