劉志斌,孫 淼,陳延飛,陳 建,李 嶺,呼延洋楠,薛青紅*,孟 賡*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

副黏病毒科(Paramyxoviridae)隸屬負(fù)鏈RNA病毒目(Mononegavirale),包含副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)和肺病毒亞科(Pneumovirinae)兩個亞科。其中大量的人畜共患病毒屬于副黏病毒亞科,共含有7個屬,包括呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬、禽腮腺炎病毒屬、麻疹病毒屬、水生類副黏病毒屬、費(fèi)爾拉副黏病毒屬和亨尼帕副黏病毒屬,見圖1[1］。其中具有代表性的感染動物和人的副黏病毒有:副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV);麻疹病毒(Measles virus,MeV);腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV);新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV);小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV);犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)以及近年來發(fā)現(xiàn)的對人類健康造成巨大危害的亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)和尼帕病毒(Nipah virus,NiV)。副黏病毒顆粒具有囊膜,呈多形性,常見圓形和橢圓形,其基因組為單股負(fù)鏈RNA,大小約為15～19 kb[2］。病毒基因組共編碼六種主要功能性蛋白,分別是核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N);基質(zhì)蛋白(matrix protein,M);附著蛋白(hemagglutinin-neuraminidase/hemagglutinin/glyco￣protein,HN/H/G);融合蛋白(fusion protein,F);磷酸化蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶(large protein,L)。N、M、HN/H/G、F、P和L蛋白作為病毒顆粒的主要組成成分,為病毒結(jié)構(gòu)蛋白(圖2)[3］。其中有兩種糖蛋白,分別是介導(dǎo)病毒與宿主表面受體結(jié)合的HN/H/G蛋白和介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合的F蛋白,這兩種纖突狀蛋白在病毒粒子囊膜上在受基質(zhì)蛋白(M)束縛的情況下呈網(wǎng)格狀排列,與病毒顆粒成熟和膜融合過程相關(guān)[4］,如圖3所示[5］。兩種糖蛋白的構(gòu)象變化及其之間的相互作用是決定這些病毒宿主范圍、毒力和傳播的關(guān)鍵,也是中和抗體篩選的重要理論基礎(chǔ),因此闡述這兩種糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對于研究副黏病毒入侵機(jī)制和疾病的預(yù)防具有十分重要的意義。本文通過對幾種代表性副黏病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)功能以及它們之間相互作用進(jìn)行了綜述,以期為治療性抗體和疫苗的合理開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

Matrix Protein(yellow)Nucleocapsid(purple)Phosphoprotein(blue)Large Polymerase(green)RNA Genome(black)

1 HN/H/G蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

1.1 HN/H/G蛋白的結(jié)構(gòu) HN/H/G蛋白是副黏病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵作用蛋白,能夠識別并結(jié)合宿主受體。HN/H/G蛋白在不同副黏病毒中的形式不盡相同,功能也有略微差異。其中最常見的形式是血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN),即同時具有血凝素活性和神經(jīng)氨酸酶活性。呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬以及禽腮腺炎病毒屬的附著蛋白常以HN類型存在[6-8］;以H(hemagglutinin)類型存在的附著蛋白只有血凝素活性,如麻疹病毒屬[9-10］;近年來,HeV和NiV給人類健康造成巨大危害,其附著蛋白缺乏血凝素及神經(jīng)氨酸酶活性,因此使用糖蛋白(glycoprotein,G)來直接表示[11］。雖然HN/H/G蛋白以不同類型存在,但都是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白。其在序列上的功能結(jié)構(gòu)組成分為四部分(圖4),即N末端的胞質(zhì)尾區(qū)(Cytoplasmic tail domain,CT)、N端單跨膜區(qū)域(Transmembrane region,TM)、莖部結(jié)構(gòu)域(Stalk domain)和較大的C端球狀頭部結(jié)構(gòu)域(Head domain)。N端的CT、TM以及莖部結(jié)構(gòu)域主要由α-螺旋組成,C端的頭部結(jié)構(gòu)域主要由β-折疊片組成[12］。

圖4 副黏病毒HN/H/G蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

對重組表達(dá)的HN/H/G蛋白晶體結(jié)構(gòu)及冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的解析有利于研究蛋白生化性質(zhì)及其生物活性。多個副黏病毒家族的HN/H/G蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析(表1)[13-32］。下面以MeV、NiV、HeV和NDV為例,闡述HN/H/G蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

表1 已解析結(jié)構(gòu)的副黏病毒蛋白列表(部分)

MeV的附著蛋白有血凝素活性但沒有神經(jīng)氨酸酶活性,因此以H類型存在,由34個殘基的細(xì)胞質(zhì)尾,24個殘基的跨膜區(qū),95個殘基的莖部以及頭部組成。其頭部的晶體結(jié)構(gòu)最早在2006年由Garcia課題組解析(圖5)[16］,隨后MeV頭部與受體SLAM、CD46及Nectin-4的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)被陸續(xù)解析。晶體結(jié)構(gòu)顯示MeV的H蛋白頭部由六個β-片層組成的螺旋槳結(jié)構(gòu),是參與細(xì)胞表面蛋白受體識別的主要區(qū)域,其整體的結(jié)構(gòu)呈立方體型,頭部結(jié)構(gòu)域在晶體不對稱單位內(nèi)以傾斜的形式以二硫鍵連接形成同源二聚體,相鄰兩個不對稱單位的二聚體進(jìn)而形成不同形式的同源四聚體,但具體在病毒表面究竟以何種形式存在依然未知[33］。MeV-H蛋白和受體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示,其頭部螺旋槳結(jié)構(gòu)中的6個β-折疊片層(圖5),其中β-片層4、5和6主要參與結(jié)合了不同的細(xì)胞受體,且受體結(jié)合面有重合[34］。NiV以及HeV的附著蛋白缺少血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性,以G來表示。2022年通過對NiV病毒胞外區(qū)及抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析,顯示NiV的G蛋白含有N端四聚體螺旋束(Four-Helix Bundle,4HB)的莖部結(jié)構(gòu)(96-147aa),頸部結(jié)構(gòu)域(148-165aa),連接區(qū)(166-177aa)和C端頭部結(jié)構(gòu)域(178-602aa)。其莖部與頸部通過形成二硫鍵來保持NiV-G四聚體的穩(wěn)定,C端頭部形成一個6個β-折疊片組成的螺旋槳型結(jié)構(gòu),與MeV的頭部結(jié)構(gòu)類似。但不同的是,NiV-G整體結(jié)構(gòu)采用了雙頭向上和雙頭向下構(gòu)象,這跟NDV-HN蛋白和MeV-H蛋白的四頭向下構(gòu)象有所不同(圖6)[30］。同樣由于NiV-G的結(jié)構(gòu)是使用抗體鎖定構(gòu)象的重組蛋白結(jié)構(gòu),因此其在病毒表面的原位結(jié)構(gòu)依然有待于進(jìn)一步研究。NDV是典型的動物副黏病毒,其附著蛋白同時具有血凝素活性和神經(jīng)氨酸酶活性,是經(jīng)典的HN蛋白。研究學(xué)者通過晶體結(jié)構(gòu)電子密度圖觀測到NDV-HN蛋白的莖部區(qū)域?yàn)橐粋€4HB,包含一個十一肽疏水重復(fù)區(qū)域[35］,其氨基酸殘基83-114位點(diǎn)構(gòu)成了莖部的疏水性核心,同一區(qū)域與PIV5-HN類似。這表明,NDV-HN莖部區(qū)域的構(gòu)象在某些副黏病毒中可能是一種保守的共性結(jié)構(gòu)。NDV-HN球形頭部的晶體結(jié)構(gòu)顯示其以二聚體-二聚體形式排列,在未結(jié)合受體前呈現(xiàn)四頭向下構(gòu)象,其中頭部區(qū)域包含受體結(jié)合區(qū)域和NA活性區(qū)域,在其頂部含有唾液酸結(jié)合受體,頭部區(qū)域末端含有45個氨基酸的延伸[15］。由于晶體結(jié)構(gòu)的多聚狀態(tài)可能由于晶體內(nèi)堆積導(dǎo)致的假象,因此其在病毒顆粒表面是否以晶體結(jié)構(gòu)的四聚體形式存在依然未知。通過總結(jié)分析不同副黏病毒HN/H/G蛋白的結(jié)構(gòu),我們認(rèn)為副黏病毒HN/H/G蛋白具有以下共性,HN/H/G蛋白的C端頭部區(qū)域均含有受體結(jié)合位點(diǎn)并且以β-螺旋折疊為特征的多聚體的形式存在;莖部結(jié)構(gòu)域均為四聚體螺旋束結(jié)構(gòu)且含有疏水特性,推測可能是一種保守的共性結(jié)構(gòu);N端的CT、TM以及莖部結(jié)構(gòu)域多為α-螺旋結(jié)構(gòu)組成,這可能是行使HN/H/G蛋白正常功能的某種必須結(jié)構(gòu)。

A、b:MeV H蛋白的兩個結(jié)構(gòu)示意圖以及麻疹病毒顆粒示意圖

1.2 HN/H/G蛋白的功能 在病毒入侵宿主的初始階段,HN/H/G蛋白通過與宿主受體的識別與結(jié)合來介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合。但副黏病毒種類不同,結(jié)合的細(xì)胞表面受體也有所差異,例如NDV-HN蛋白結(jié)合唾液酸受體;MeV-H蛋白與受體淋巴細(xì)胞活化分子(SLAM)、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(CD46)和黏附連接蛋白(Nectin-4)結(jié)合;PPRV-H蛋白與受體SLAM和Nectin-4結(jié)合,不與CD46結(jié)合;而NiV-G蛋白以跨膜蛋白酪氨酸激酶Ephrin B2及Ephrin B3(EB2,EB3)作為受體[36］。不同種類的副黏病毒結(jié)合受體的位置也有所不同,復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示,MeV-H在頭部區(qū)域的側(cè)面與受體結(jié)合;而對NDV-HN和NiV-G的生化研究數(shù)據(jù)顯示,其在頭部區(qū)域的頂端結(jié)合受體[9,11,37］。目前的研究猜測,HN/H/G蛋白與受體結(jié)合后引起蛋白構(gòu)象的改變,從而暴露了在莖部的F蛋白激活位點(diǎn),進(jìn)而觸發(fā)了F蛋白發(fā)生自身的一系列構(gòu)象變化。有學(xué)者通過將NDV-HN蛋白的莖部與NiV-G的頭部區(qū)域嵌合,發(fā)現(xiàn)HN蛋白只在與HN蛋白莖段同源的F蛋白表達(dá)時才會導(dǎo)致融合,企圖證明是HN蛋白的莖部而不是頭部負(fù)責(zé)與F蛋白的相互作用[38］。有研究者對NiV-G蛋白莖部結(jié)構(gòu)域引入N聯(lián)糖基化位點(diǎn)突變,發(fā)現(xiàn)突變體不影響與受體結(jié)合,也不影響G蛋白與F蛋白之間的相互作用,但卻顯著降低了病毒與細(xì)胞膜的融合[39］,因而推測NiV的G與F蛋白相互作用并不完全被莖部結(jié)構(gòu)介導(dǎo)[40］。后來Jacquelyn等[41］通過生化方法研究認(rèn)為NiV-G和F之間存在雙齒相互作用,其中NiV-G的莖部和頭部區(qū)域都與F相互作用。但最近幾年對于副黏病毒HN/H/G蛋白的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),不同副黏病毒的HN/H/G蛋白頭部區(qū)域四聚體采取了完全不同的多聚構(gòu)象(圖7)[35］,所以許多體外蛋白質(zhì)生化數(shù)據(jù)還沒有很好的和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)吻合。而2023年通過CryoET對PIV3全病毒顆粒的結(jié)構(gòu)解析得到了9?的HN和F原位電子密度圖,其結(jié)構(gòu)顯示PIV3的HN蛋白在病毒表面是通過二聚體與F相互作用的(圖7),且通過HN頭部區(qū)域的一個環(huán)狀區(qū)(loop structure)參與F相互作用(圖8)[42］。但是由于CryoET的分辨率比較低,且計算結(jié)果容易出錯,因此在缺乏進(jìn)一步的高分辨率結(jié)構(gòu)信息前,其結(jié)論還有待驗(yàn)證。

圖7 不同副黏病毒(CDV、NiV、PIV5、NDV)HN/H/G蛋白四聚體結(jié)構(gòu)比較

圖8 副黏病毒(副流感病毒3)HN蛋白與F蛋白的相互作用

通過總結(jié)分析不同副黏病毒HN/H/G蛋白的研究結(jié)果,我們認(rèn)為副黏病毒的HN/H/G蛋白至少具有三個確鑿的功能:(1)特異性的識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體,促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合;(2)與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合后,HN/H/G蛋白自身構(gòu)象發(fā)生改變,從而暴露F蛋白激活位點(diǎn),啟動病毒與細(xì)胞融合過程;(3)具有神經(jīng)氨酸酶活性的病毒HN蛋白,催化末端唾液酸糖苷鍵的水解,促進(jìn)子代病毒顆粒從細(xì)胞膜上釋放[14］。另外,基于Battisti和Meng在NDV-M蛋白組裝的研究結(jié)果推測[5］,由于F蛋白三聚體和M蛋白二聚體網(wǎng)格之間存在著對稱性不匹配,因此附著蛋白通過與F蛋白相互作用,進(jìn)一步行使介導(dǎo)了F蛋白組裝進(jìn)病毒顆粒的功能。由于NDV-M蛋白的組裝模型已在NiV和MeV中都得到了驗(yàn)證,因此這種M-HN-F的組裝模式可能在副黏病毒中是一種保守且通用的模型(圖3)。

2 F蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

2.1 F蛋白的結(jié)構(gòu) F蛋白低聚物是典型的Ⅰ型病毒融合蛋白,由兩個亞基(F1,F2)以二硫鍵結(jié)合組成的同源三聚體形式(圖9)。與其他Ⅰ型病毒融合蛋白一樣,副黏病毒的F蛋白包含疏水性融合肽(Fusion Peptide,FP),兩個7肽重復(fù)區(qū)(Heptad repeat regions A and B,HRA和HRB),一個跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain,TM)以及C末端的胞質(zhì)尾區(qū)(Cytoplasmic Tail,CT)。F蛋白在合成前以無活性的F0前體形式存在,必須形成二硫鍵連接的F1,F2形式時才具備融合活性。當(dāng)融合肽被激活后,F蛋白的七肽重復(fù)區(qū)重新排列,構(gòu)象發(fā)生不可逆的變化,形成穩(wěn)定的六螺旋束結(jié)構(gòu)(Six-helix bundle,6HB)[3］。具體構(gòu)象重排步驟如下:(1)緊湊的莖部結(jié)構(gòu)域HRB解螺旋;(2)HRA段的單體折疊成卷曲的螺旋狀,從而允許FP發(fā)生遷移并插入到目標(biāo)段,形成中間過渡體;(3)HRB肽擺動頭部域,形成新的6-螺旋核心結(jié)構(gòu),最終成為融合后狀態(tài)。F蛋白的酶切激活過程是病毒感染致病的關(guān)鍵步驟。F蛋白被酶切后,會產(chǎn)生一個新的蛋白質(zhì)的N末端,FP會處于正確的有利于膜融合的位置。大多數(shù)的副黏病毒F蛋白酶切過程發(fā)生在病毒向高爾基體的運(yùn)輸中,是由一類枯草桿菌樣細(xì)胞內(nèi)蛋白酶進(jìn)行酶切的,如弗林(Furin)蛋白[6］。但并不是所有副黏病毒的F蛋白都是被Furin蛋白酶切激活的,如HeV和NiV的F蛋白是被蛋白酶L酶切激活[43-44］;HPIV5的F蛋白是被細(xì)胞外源性蛋白酶切割激活,如小纖溶酶(Mini-plasmin)[45］。

圖9 副黏病毒F蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

近年來,F蛋白融合前及融合后狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)也逐步被解析,如PIV5、HeV、MeV和NDV等。副黏病毒F蛋白融合前狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)為樹狀結(jié)構(gòu),主要是莖部的HRB區(qū)域組成的三螺旋束支撐一個大的球狀頭部區(qū)域。頭部區(qū)域分成三個部分即DⅠ、DⅡ、DⅢ。DⅠ和DⅡ是形成頭部結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ),DⅢ部分是由位于頂部的HRA段組成。F蛋白融合前與融合后結(jié)構(gòu)差異主要在DⅢ[46］,如圖10所示。

圖10 副黏病毒F蛋白分子結(jié)構(gòu)

雖然已解析的副黏病毒F蛋白胞外域結(jié)構(gòu)都很相似,但其受體依賴的融合觸發(fā)機(jī)制是否相似還具有爭議,其激活過程也存在一定的差異。以HeV和PIV5為例,其F蛋白的胞外域結(jié)構(gòu)非常相似,但二者在融合肽區(qū)域具有較大差異。HeV-F在109裂解位點(diǎn)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)更長且更窄,這可能是由于HeV-F的特異性激活酶是組織蛋白酶L,而PIV5-F是由弗林蛋白酶激活,進(jìn)而導(dǎo)致F蛋白結(jié)構(gòu)上的差異[47］。

副黏病毒的F蛋白大多數(shù)在預(yù)融合狀態(tài)都不穩(wěn)定。MeV-F蛋白的結(jié)構(gòu)顯示其第六葉片的螺旋結(jié)構(gòu)排列不緊密可能是造成其F蛋白預(yù)融合不穩(wěn)定的原因之一。因此在MeV-F的結(jié)構(gòu)研究中,研究者在MeV-F的莖部區(qū)域引入二硫鍵以穩(wěn)定重組表達(dá)的MeV-F蛋白的預(yù)融合狀態(tài),并且發(fā)現(xiàn)在HRB的C末端引入4個半胱氨酸是最合適的[17］。而這種在副黏病毒F蛋白結(jié)構(gòu)中插入二硫鍵來穩(wěn)定其預(yù)融合構(gòu)象是常用的副黏病毒F蛋白結(jié)構(gòu)研究的策略。

2.2 F蛋白的功能 副黏病毒的F蛋白是行使病毒和細(xì)胞膜融合的功能蛋白,各種證據(jù)顯示其預(yù)融合狀態(tài)不穩(wěn)定,需要HN/H/G蛋白維持。HN/H/G蛋白與受體結(jié)合后,激活F蛋白開始膜融合。作為膜融合機(jī)制作用蛋白,F蛋白與病毒的毒力密切相關(guān),是作為疫苗研究的主要靶點(diǎn),如在RSV的疫苗研究中主要就是圍繞著如何穩(wěn)定RSV-F蛋白三聚體預(yù)融合狀態(tài)而開展的[20］。同時,副黏病毒感染過程中發(fā)生的組織壞死可能與F蛋白作用相關(guān):副黏病毒F蛋白在宿主細(xì)胞膜上的表達(dá)介導(dǎo)了相鄰的細(xì)胞發(fā)生融合,形成合胞體,最終導(dǎo)致細(xì)胞病變而進(jìn)一步發(fā)生組織壞死。

3 副黏病毒糖蛋白之間的相互作用

3.1 蛋白互作的模型假說 副黏病毒的糖蛋白對其生物學(xué)活性具有重要作用,關(guān)于F與HN/H/G蛋白之間的相互作用有很多相關(guān)研究報道。學(xué)術(shù)界曾提出了兩種模型來解釋它們之間的相互作用,夾鉗模型和破壞模型[1］。夾鉗模型認(rèn)為,F蛋白同HN/H/G蛋白在細(xì)胞內(nèi)就已經(jīng)存在相互作用,二者以復(fù)合體的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面,HN/H/G蛋白夾鉗住F蛋白,使得F蛋白處于亞穩(wěn)定的狀態(tài),當(dāng)HN/H/G蛋白與受體結(jié)合后會釋放F蛋白,激活F蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變,從而啟動膜融合過程。大部分副黏病毒的生化研究支持這種模型[30,48］,同時所有的結(jié)構(gòu)研究支持這種模型。破壞模型認(rèn)為,F蛋白與HN/H/G蛋白開始并不存在相互作用,二者獨(dú)立轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面,當(dāng)HN/H/G蛋白結(jié)合受體后將激活信號傳遞給F蛋白,從而引發(fā)F蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變,完成融合。對NDV的部分生化研究支持破壞模型,但相關(guān)證據(jù)有可能是Co-IP實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的假象[49］,這種模型至今還未得到結(jié)構(gòu)上實(shí)際觀察的驗(yàn)證。

3.2 蛋白間互作區(qū)域研究 在兩者之間的特異性作用的具體區(qū)域研究中,在沒有足夠的結(jié)構(gòu)信息前,學(xué)者更多的使用生化方法驗(yàn)證蛋白及多肽間的相互作用。有學(xué)者將NDV-F和PIV-F的跨膜部分和莖部交接處進(jìn)行片段切割交換后,并不影響其細(xì)胞融合功能,進(jìn)一步將F2片段進(jìn)行交換后也不影響各自的細(xì)胞融合功能,而將F的頭部進(jìn)行交換后,F蛋白的融合功能消失。這說明F蛋白分子上與同源HN蛋白分子相互作用的特異性區(qū)域位于F1的胞外區(qū)域[50］。而副黏病毒HN/H/G蛋白上與F蛋白相互作用的區(qū)域卻依然未知。在NDV的研究中發(fā)現(xiàn),HN莖部第49-143位氨基酸之間存在一個能增強(qiáng)F蛋白融合活性的區(qū)域,推測NDV-H的跨膜區(qū)和莖部區(qū)域共同決定融合作用的特異性[51］。而另一些研究表明NDV-HN的球狀頭部具有抑制F促進(jìn)融合的作用,與HN頭部區(qū)域?qū)δと诤线^程中F蛋白具有促進(jìn)作用的理論存在矛盾[52］。在PIV-2的研究中,PIV-2的HN蛋白頭部區(qū)域以及F蛋白HR1、HR2三個蛋白被重組表達(dá)純化,經(jīng)體外結(jié)合試驗(yàn)及質(zhì)譜與圓二色譜分析,結(jié)果表明PIV-2的HN頭部區(qū)域與 HR1和HR2都能結(jié)合,并且結(jié)合后的蛋白構(gòu)象及多肽構(gòu)象都發(fā)生變化,進(jìn)而推測PIV-2的HN頭部區(qū)域可能是與F蛋白的結(jié)合作用域[53］。對PIV3全病毒顆粒的9?結(jié)構(gòu)解析顯示PIV3的HN蛋白是通過頭部區(qū)域的一個環(huán)狀區(qū)(Loop structure)參與F相互作用(圖8),且穩(wěn)定了F三聚體的融合前構(gòu)象[42］。針對目前的研究現(xiàn)狀,未能對于兩者蛋白相互作用區(qū)域作出一個確切又合理的解釋,推測這可能是由于蛋白不同結(jié)構(gòu)域之間存在聯(lián)合作用機(jī)制或者兩種蛋白相互作用后構(gòu)象改變引起功能的變化所導(dǎo)致的。

3.3 構(gòu)象變化與蛋白互作的關(guān)系 基于已有的生化證據(jù)表明,副黏病毒的HN/H/G蛋白和F形成的復(fù)合物在與受體結(jié)合前后存在著構(gòu)象變化,這種構(gòu)象變化提供了F蛋白介導(dǎo)膜融合所需的條件。一般認(rèn)為,在HN/H/G蛋白與受體相互作用之前,HN/H/G蛋白如同夾子一樣握住 F 蛋白,使其以穩(wěn)定的融合前體存在;當(dāng)HN/H/G蛋白與受體結(jié)合發(fā)生作用時,蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,從而使F蛋白脫離HN/H/G蛋白并發(fā)生重排,以中間體和融合后形式存在[54］。Porotto等[55］基于細(xì)胞表達(dá)NDV-HN、NIV-G、PIV3-H和PIV3-F的研究發(fā)現(xiàn),在膜融合的全過程中HN/H/G蛋白對F蛋白不斷地激活,這表明可能存在更復(fù)雜的相互作用,但實(shí)驗(yàn)證據(jù)并不確鑿。由于副黏病毒HN/H/G蛋白功能及構(gòu)象差異較大,受體及受體結(jié)合位點(diǎn)也不一樣,因此不同副黏病毒HN/H/G蛋白及F蛋白復(fù)合物的受體結(jié)合后構(gòu)象變化可能并不相同。

關(guān)于MeV-H和F蛋白在病毒入侵階段的相互作用以及其相互誘導(dǎo)的構(gòu)象變化一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn),同時由于其受體為蛋白,因此相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為豐富。張鵬在試驗(yàn)中通過在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含H和F以及受體SLAM基因的表達(dá)質(zhì)粒,對它們的相互作用及其功能進(jìn)行了初步研究。單獨(dú)表達(dá)F和H蛋白時,在細(xì)胞表面呈分散狀態(tài)。同時表達(dá)F、H及SLAM受體時出現(xiàn)明顯的極化,呈帽子狀[56］。這一結(jié)果表明,H蛋白和F蛋白以及受體SLAM蛋白之間存在很強(qiáng)的相互作用,以形成一個功能化的復(fù)合體引發(fā)病毒入侵過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MeV-H蛋白兩個面對面的二聚體頭部相對移動可以向F蛋白傳遞信號,從而引發(fā)F蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,這表明H蛋白頭部介導(dǎo)了融合觸發(fā)信號的傳遞[54］。然而,Brindley等[57］通過構(gòu)建無頭的MeV-H蛋白,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的無頭的MeV-H蛋白也能有效的觸發(fā)膜融合過程,這與先前的研究存在一些不同,值得進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

3.4 受體介導(dǎo)的F蛋白激活假說 學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為副黏病毒HN/H/G蛋白由于受體的參與而發(fā)生的一些構(gòu)象變化最終引起F的激活,目前基于副黏病毒受體介導(dǎo)的F蛋白激活存在五種模型假說,分別是滑動、莖部暴露、安全捕獲、雙齒和寡聚模式,如圖11[46］?；瑒幽Ｐ驼J(rèn)為:當(dāng)與受體結(jié)合后,HN/H/G蛋白頭部構(gòu)象從平面?zhèn)认蚧瑒拥礁诲e的構(gòu)象,因此,莖部結(jié)構(gòu)會從緊密閉合的4HB結(jié)構(gòu)移動到解離構(gòu)象,進(jìn)而導(dǎo)致F蛋白從HN/H/G蛋白中解離,該模型推斷,當(dāng)與受體結(jié)合后,頭部會產(chǎn)生特定的信號,這些信號向下傳遞到莖部以激活F蛋白;莖部暴露模型認(rèn)為:受體結(jié)合可能誘導(dǎo)HN/H/G蛋白的構(gòu)象變化,從四頭朝下的構(gòu)象變?yōu)槎^朝上二頭朝下的構(gòu)象,這種頭部向上的構(gòu)象會暴露附著蛋白中的莖部結(jié)構(gòu)域與F蛋白相互作用;安全捕獲模型認(rèn)為:HN/H/G蛋白頭部會在四頭向下的構(gòu)象中折疊成一個自動抑制的構(gòu)象,提前鎖定其莖部激活F蛋白的能力,這種鎖定能力將在受體結(jié)合后通過頭部的移動而解除。該模型表明,由于HN/H/G蛋白的自抑制構(gòu)象,F蛋白可以在受體結(jié)合之前與HN/H/G蛋白相互作用而不會提前觸發(fā)。該模型可以看作是上述莖部暴露模型的一個變種;雙齒模型最初是針對NiV提出的,該模型提出F蛋白與HN/H/G蛋白的頭部和莖部都有相互作用,受體結(jié)合后與融合蛋白的主要相互作用從頭部切換到HN/H/G蛋白的莖部,該模型也在不斷被證實(shí);寡聚化模型則認(rèn)為受體結(jié)合可能會導(dǎo)致附著蛋白寡聚化增加,進(jìn)而激活F蛋白。但是,由于現(xiàn)階段觀察到的不同副黏病毒的HN/H/G蛋白結(jié)構(gòu)有多種構(gòu)象,因此模型之間可能并非相互獨(dú)立,兩個或者多個模型可以適用同一種副黏病毒[58］。

圖11 副黏病毒HN/H/G蛋白激活F蛋白的模型

4 展 望

副黏病毒在世界范圍內(nèi)的流行傳播對人類健康與畜牧業(yè)發(fā)展造成重大影響,其家族包含了眾多的人畜共患病毒,關(guān)于副黏病毒入侵機(jī)制的研究也一直是學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)。副黏病毒糖蛋白的吸附和融合作用是病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵步驟,在研究病毒入侵機(jī)制以及疾病防治環(huán)節(jié)都處于非常重要的地位。本文總結(jié)了近年來副黏病毒糖蛋白的相關(guān)研究,其分子結(jié)構(gòu)及相互作用機(jī)制研究已經(jīng)較深入,通過對副黏病毒糖蛋白的相關(guān)闡述,以期為揭示病毒入侵宿主細(xì)胞機(jī)制提供參考,同時希望對于未來新型疫苗的研發(fā)以及疫病的防治奠定理論基礎(chǔ)。目前研究成果初步說明了,各病毒成員之間的糖蛋白結(jié)構(gòu)、HN/H/G蛋白頭部受體結(jié)合位點(diǎn)以及它們之間的相互作用等方面均存在差異,但也有許多的共性。不同病毒糖蛋白的具體相互作用機(jī)制是一項(xiàng)較為復(fù)雜的研究,功能性蛋白多聚體、整體復(fù)合物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)以及介導(dǎo)它們相互作用的蛋白殘基的分子性質(zhì)在很大程度上還是未知的,這些問題阻礙了基于結(jié)構(gòu)的新型特異性抗體的開發(fā)。為了解決這些問題,可能需要對完整的、天然的病毒糖蛋白復(fù)合物進(jìn)行低溫電子層析,并在相關(guān)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)的功能和生化分析,這將對研究病毒的入侵以及新型特異性抗體和疫苗的研發(fā)提供有力支撐[59］。目前副黏病毒的研究大多與人類疾病相關(guān),而副黏病毒絕大多數(shù)是人畜共患傳染病,加強(qiáng)對動物副黏病毒入侵機(jī)制的深入研究,對未來人獸共患疫病的防治同樣具有重要意義。