張傳津,牛華星,韓會(huì)剛*,戰(zhàn)余銘 ,李有志,王尚明,張志民

(1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心,濟(jì)南 250010;2.山東迅達(dá)康獸藥有限公司,濟(jì)南 250306)

板青敗毒口服液現(xiàn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版中藥卷,具有清熱解毒,疏風(fēng)活血的功效,臨床上主要用于雞傳染性法氏囊病等病毒性疾病的輔助治療[1］。現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)四個(gè)薄層色譜法,分別采用綠原酸對(duì)照、甘草酸銨對(duì)照、精氨酸對(duì)照、芍藥苷對(duì)照開展薄層鑒別,供試品前處理繁瑣,同時(shí)展開劑采用乙酸丁酯、甲酸、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、三氯甲烷等多種有機(jī)溶劑,污染大,薄層展開耗時(shí)長(zhǎng),而且方中金銀花、蒲公英、白英都含有或多或少的綠原酸;板藍(lán)根、大青葉都含有精氨酸,因此本方法專屬性差,重復(fù)性也不好,導(dǎo)致結(jié)果不易判定。中藥多組分、多靶點(diǎn)的生物特性是其發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ),因此如何對(duì)中藥復(fù)雜多樣的化學(xué)成分體系進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)也是重點(diǎn)難點(diǎn)。指紋圖譜、特征圖譜具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點(diǎn),是公認(rèn)的現(xiàn)代中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)最為常用的分析方法之一,可宏觀反映中藥化學(xué)信息的整體狀況,實(shí)現(xiàn)中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效表征,從整體上提高了中藥質(zhì)量控制水平[2-3］。基于此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法,以方中藥物組分為依據(jù),選取色譜中重要的特征信息,采用乙腈-0.4%磷酸溶液系統(tǒng)建立了板青敗毒口服液特征圖譜分析方法,為全面有效控制板青敗毒口服液內(nèi)在質(zhì)量提供有力的技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AE240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);WatersE2695高效液相色譜儀,二極管陣列PDA檢測(cè)器(美國(guó)沃特世公司);KQ-400DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);Milli-Q型超純水儀(AdvantageA10)。

1.2 材料 乙腈為色譜純,磷酸為優(yōu)級(jí)純(含量大于85%),甲醇為分析純,水為超純水;對(duì)照品信息、樣品信息分別見表1、表2。

表1 對(duì)照品信息表

表2 板青敗毒口服液樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用Waters XBridge C18色譜柱(粒徑為3.5 μm,4.6 mm×250 mm);以乙腈流動(dòng)相A相,以0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按表3中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm,流速為1.2 mL/min,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣體積10 μL,理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

2.2 參照物溶液的制備 分別取新綠原酸對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、隱綠原酸對(duì)照品、單咖啡酰酒石酸對(duì)照品、(R,S)-告依春對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品、連翹苷對(duì)照品、咖啡酸對(duì)照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加70%甲醇制成每1 mL各含新綠原酸50 μg、綠原酸50 μg、單咖啡酰酒石酸50 μg、(R,S)―告依春2 μg、咖啡酸10 μg、隱綠原酸50 μg、甘草酸銨50 μg、連翹苷10 μg的混合溶液,即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2 mL,置50 mL棕色量瓶中,加入50%甲醇適量,超聲處理20分鐘(功率500 W,頻率40k Hz),放冷,加50%甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以PDA檢測(cè)器3D掃描190～450 nm波長(zhǎng)范圍,通過(guò)不同波長(zhǎng)色譜圖的對(duì)比發(fā)現(xiàn),在240 nm處各種化合物均有良好的響應(yīng)值,且各峰分離良好,最終選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一份樣品,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10 μL,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD< 0.2%,各色譜峰峰面積的RSD<0.4%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品,按上述色譜條件測(cè)定,分別在 0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL,各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.12%,結(jié)果表明板青敗毒口服液樣品穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批供試品樣品,重復(fù)配制6份供試品溶液,各取10 μl注入色譜儀,將色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”,以對(duì)照色譜圖為參照?qǐng)D譜,采用平均數(shù)、時(shí)間窗為0.6,計(jì)算6份樣品相似度,結(jié)果顯示其相似度均大于0.999,表明重復(fù)性良好,符合要求,結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性相似度計(jì)算結(jié)果

2.5.4 不同色譜柱耐用性 分別使用waters XBridge C18(3.5 μm,4.6 mm×250 mm)、賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司Syncronis C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)兩根色譜柱,對(duì)6批供試品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果相似度(S12)均大于0.995,符合特征圖譜技術(shù)要求(應(yīng)不低于0.95)。

2.6 板青敗毒口服液特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.6.1 特征圖譜的建立 按2.1項(xiàng)下色譜條件,測(cè)定混合參照物溶液及6批板青敗毒口服液樣品,將色譜圖的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”,以S1 為參照?qǐng)D譜,進(jìn)行自動(dòng)匹配,計(jì)算6批板青敗毒口服液與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度。共有8個(gè)特征峰,參照物色譜圖及樣品色譜圖見圖1,不同批次樣品疊加特征圖見圖2。

(A.對(duì)照品 B.板青敗毒口服液樣品;1.新綠原酸,2.(R,S)告依春,3.單咖啡酰酒石酸,4.綠原酸,5.咖啡酸;6.隱綠原酸;7.連翹苷;8.甘草酸銨)

圖2 板青敗毒口服液不同批次疊加圖譜

2.6.2 共有特征峰的確認(rèn) 將參照物溶液中與板清敗毒口服液中相應(yīng)的8個(gè)共有峰,通過(guò)色譜圖與光譜圖比對(duì)均有很好的重合性。同時(shí)確認(rèn)1號(hào)峰為新綠原酸,2號(hào)峰為(R,S)-告依春,3號(hào)峰為單咖啡酰酒石酸,4號(hào)峰為綠原酸,5號(hào)峰為咖啡酸;6號(hào)峰為隱綠原酸,7號(hào)峰為連翹苷,8號(hào)峰為甘草酸銨。板青敗毒口服液處方中金銀花、白英藥材中均有較高含量的綠原酸,蒲公英藥材也含有少量綠原酸,所以綠原酸在口服液中的含量相對(duì)較高,出峰時(shí)間也較適宜,因此,設(shè)定為參考峰S,并計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示,各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.5%,表明具有較好的重現(xiàn)性。按照技術(shù)要求,初步得到板清敗毒口服液的特征圖譜的技術(shù)參數(shù)(表5)。

表5 板清敗毒口服液HPLC特征圖譜中特征峰保留時(shí)間

表6 特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度計(jì)算結(jié)果

表7 樣品特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度匹配結(jié)果

2.6.3 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果 將6批板清敗毒口服液樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”,得出相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表(表4、表5)。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)成份的確定 板青敗毒口服液處方包含金銀花、大青葉、板藍(lán)根、蒲公英、白英、連翹、甘草、天花粉、白芷、防風(fēng)、赤芍、浙貝母12味中藥,我們對(duì)單味藥材進(jìn)行處理,分析檢測(cè),結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)選擇各種藥材合適的質(zhì)控指標(biāo)組分。白英(Solanum lyratum Thunb)為茄科植物白英的全草,主要含皂苷類、甾體類化合物、有機(jī)酸、黃酮類等組分,其中綠原酸含量較高,也含有少量的咖啡酸[4-6］,這兩種組分都是《中國(guó)獸藥典》常采納的質(zhì)控指標(biāo)組分;金銀花是大宗常用藥材,隨著現(xiàn)代藥理研究的深入,金銀花的質(zhì)控指標(biāo)性成分已達(dá)15種之多,分別是有機(jī)酸酸類(綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸 B、菊苣酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸等)、黃酮類(金絲桃苷、蘆丁、木犀草苷、槲皮素等)、環(huán)烯醚萜類(馬錢苷酸、馬錢苷、7-表-馬錢苷、獐芽菜苷、斷氧化馬錢苷等)[7-9］,其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸是金銀花含量較高的酚酸類組分,也是《中國(guó)藥典》采納的主要質(zhì)控指標(biāo)組分[10］;蒲公英為菊科多年生草本植物,具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋的功效[11］,現(xiàn)代藥理研究表明,蒲公英主要含多酚酸類、萜類、植物甾醇類、倍半萜內(nèi)酯類和香豆素類等多種化學(xué)成分[12］,其中酚酸類化合物是蒲公英發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ),目前從蒲公英中分離得到的酚酸類化合物有32種,其中單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸是含量較高的5個(gè)主要有效成分[13］?！吨袊?guó)藥典》2020年版以菊苣酸的含量作為蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[10］,《中國(guó)獸藥典》2020 年版以咖啡酸的含量作為蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[14］;板藍(lán)根、大青葉所含有的氨基酸類、核苷類、黃酮類、嘌呤、靛藍(lán)、靛玉紅等成份是近年來(lái)質(zhì)量控制的常用指標(biāo)成份[15-18］,其中(R,S) - 告依春、尿苷、鳥苷、腺苷是板藍(lán)根特征圖譜研究?jī)?yōu)選組分[14,19-20］。綜上所述,本文前期摸索中,擬實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo):其中板藍(lán)根、大青葉:(R,S)-告依春、腺苷;金銀花、蒲公英和白英:新綠原酸、單咖啡酰酒石酸、隱綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、菊苣酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?其中單咖啡酰酒石酸是本方中蒲公英特有的組分;甘草:甘草酸和甘草苷;連翹:連翹苷、連翹酯苷A;赤芍:芍藥苷[14］。后期根據(jù)實(shí)際樣品檢測(cè)情況,基質(zhì)背景干擾、分離度和各組分含量高低,刪掉了部分目標(biāo)化合物,成功建立了板青敗毒口服液中8種有效成分(新綠原酸、(R,S)告依春、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、連翹苷、甘草酸銨)的特征圖譜。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本文采用梯度洗脫的方式,PDA檢測(cè)器,3D掃描范圍190～450 nm,2D檢測(cè)波長(zhǎng),選擇250 nm(芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)),240 nm(R,S)―告依春最大吸收波長(zhǎng)),277 nm(連翹苷最大吸收波長(zhǎng)),322 nm(咖啡酸最大吸收波長(zhǎng)),327 nm(綠原酸等系列化合物最大吸收波長(zhǎng)),251 nm(甘草酸最大吸收波長(zhǎng)),329 nm(單咖啡酰酒石酸、菊苣酸最大吸收波長(zhǎng))328 nm(連翹酯苷A、最大吸收波長(zhǎng))等。由于(R,S)-告依春最大吸收波長(zhǎng)240 nm,而在251 nm、324 nm、327 nm、330 nm等處吸收太小,因(R,S)-告依春在方中含量較低,所在優(yōu)選它的最大吸收波長(zhǎng)處,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在240 nm處各種化合物均有良好的響應(yīng)值,且各峰分離良好,最終選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 色譜柱的選擇 本文先后測(cè)試6根色譜柱,分別為英國(guó)ACE EXCEL3 C18-AMIDE(3.0 μm,4.6×150 mm),Agilent Eclipse plus C18(5 μm,4.6×250 mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm,4.6×250 mm)、waters XBridge C18(3.5 μm,4.6×250 mm)、waters AtlantisT3(5 μm,4.6×250 mm)、賽默飛世爾科技(中國(guó))Syncronis C18(5 μm,4.6×250 mm),結(jié)果只有XBridge C18、Syncronis C18兩種色譜柱分離度符合要求,進(jìn)一步進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn),對(duì)6批供試品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果相似度均大于0.995;而其余色譜柱未達(dá)到基線分離,分離度不符合要求。因此本實(shí)驗(yàn)需要指定色譜柱型號(hào),分別為Syncronis C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)、XBridge C18(3.5 μm,4.6 mm×250 mm)兩種色譜柱。

板青敗毒口服液由金銀花、大青葉、板藍(lán)根、蒲公英、白英、連翹、甘草、天花粉、白芷、防風(fēng)、赤芍、浙貝母共12味藥組成,經(jīng)提取精制而成的口服溶液劑。本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC-PDA法,選取方中金銀花、蒲公英、白英、甘草、連翹這些藥材比較重要的8個(gè)特征指標(biāo)成分,建立板青敗毒口服液 HPLC 特征圖譜,作為控制板青敗毒口服液質(zhì)量的鑒別手段,靈敏度高,重復(fù)性好,確保其內(nèi)在質(zhì)量的均一、穩(wěn)定。綜上所述,采用指紋圖譜、特征圖譜能夠反映中藥多成分特點(diǎn),在中藥質(zhì)量控制中具有優(yōu)勢(shì),也是世衛(wèi)組織認(rèn)同的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,是中獸藥標(biāo)準(zhǔn)提升的有效手段。本方法供試品前處理及流動(dòng)相僅用到甲醇、乙腈兩種有機(jī)溶媒,對(duì)環(huán)境友好,且前處理簡(jiǎn)單,大大縮短檢測(cè)時(shí)間,提高了工作效率?？勺鳛榘迩鄶《究诜河行У蔫b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。