劉孟嘯,蔡 姝,劉建釵,趙中偉,孫 寧,曲光剛,苗立中

(1.河北工程大學(xué),生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056038;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),動物科技技術(shù)學(xué)院、動物醫(yī)學(xué)院,武漢 430070;3.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;4.山東省北鎮(zhèn)中學(xué),山東濱州 256200;5.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

鴨腺病毒3型(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)是2014年在我國廣東的番鴨中分離到的新型鴨腺病毒,其致病力較強(qiáng),臨床剖檢的病鴨主要表現(xiàn)在肝臟腫大,斑駁狀出血,甚至是壞死,發(fā)病率在45%～60%,常常誘發(fā)鴨第二次感染,死亡率達(dá)到35%以上[1］。根據(jù)國際病毒分類委員會(International committee on taxonomy of viruses, ICTV)的分類,DAdV-3屬于禽腺病毒屬[2］,具有禽腺病毒一般結(jié)構(gòu)[3］,直徑在60 nm～80 nm,雙鏈DNA病毒,無囊膜,呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒粒子的衣殼有三種結(jié)構(gòu)蛋白,分別是六鄰體(Hexon)、五鄰體(Penton)和纖突(Fiber)。腺病毒Hexon基因是編碼主要表面抗原蛋白,由于該基因保守區(qū)域較高[4-6］,常作為靶基因用于檢測腺病毒。

目前,DAdV-3的檢測方法有很多種,最經(jīng)典和最準(zhǔn)確的是病毒分離鑒定[7-8］,但是檢測時間較長,不能滿足臨床快速檢測的需求。分子生物學(xué)檢測主要有普通PCR[9］、多種qPCR[1,10］方法(例如染料、探針和MGB探針)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)[11］。2020年,曹秀蕓等[8］建立檢測DAdV-3的PCR方法,成功擴(kuò)增出Hexon基因的目的片段。2019年,陳翠騰等分別建立SYBR Green Ⅰ、MGB TaqMan實(shí)時熒光定量PCR方法,該方法具有良好的特異性和敏感性,但依賴于熒光儀器,不方便攜帶,不能滿足現(xiàn)場檢測。2020年,陳翠騰[12］建立了LAMP技術(shù)應(yīng)用于DAdV-3的快速診斷,縮短了檢測時間,該方法易出現(xiàn)假陽性。上述方法均存在不同的缺點(diǎn)。因此,建立一種能快速,實(shí)用的現(xiàn)場檢測DAdV-3的方法十分重要。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)[13-16］是一種利用多種酶參與的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù),RPA技術(shù)可以在37 ℃～42 ℃恒溫,20 min條件下實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)擴(kuò)增[17-18］,該方法對樣本要求低,具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景[19-20］。本研究以Hexon基因為目的基因建立了DAdV-3的RPA恒溫快速檢測方法,能快速、特異地檢測到DAdV-3,為現(xiàn)場檢測DAdV-3提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 毒株和臨床樣品 鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV),鴨瘟病毒(Duck plague virus, DPV),鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus, DTMUV),鴨細(xì)小病毒(Duck parvovirus, MDPV),鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus,DRV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院鑒定及保存。55份鴨組織臨床樣本來自2018-2020年廣東地區(qū)鴨養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑 熒光定量八排管、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司;AXYGEN核酸分離試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司;Primes STAR max Premix,pMD-18T載體、DL2000 DNA Marker,TB Green?Premix Ex TaqTMII等購自TaKaRa公司;RPA恒溫檢測試劑盒來自先達(dá)基因科技有限公司;其他試劑和耗材來自生工生物工程股份有限公司;T4 DNA Ligase來自NEB(北京)有限公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞本實(shí)驗室提供。

1.3 引物、探針的設(shè)計與合成 參照GenBank中DAdV-3 Hexon基因序列(登錄號:KR135164.1, MH349773.1,MH349774.1),根據(jù)序列的高度保守區(qū)域,利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件結(jié)合TwistAmp?DNA分析設(shè)計手冊設(shè)計了特異性引物和探針。引物和探針序列(表1),均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 DAdV-3檢測引物和探針

1.4 Hexon基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 以DAdV-3的核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)體系為:Primes STAR max Premix加入12.5 μL,引物DAdV-F1/DAdV-R4(10 μmol/L)各加入1 μL,DNA模板加入1 μL,補(bǔ)足雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 10 s,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min,16 ℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定;凝膠回收并克隆至pMD18-Tvertor載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性的菌株,提取質(zhì)粒,質(zhì)粒送至上海生工測序鑒定,質(zhì)粒準(zhǔn)確無誤后計算拷貝數(shù),質(zhì)粒DNA-80 ℃保存待用。

1.5 熒光RPA恒溫快速檢測方法的建立 熒光RPA擴(kuò)增反應(yīng)體系為:溶解劑10 μL,DAdV-F1 1 μL(10 μmol/L),DAdV-R4 1 μL(10 μmol/L),DAdV-P 0.3 μL(10 μmol/L),激活劑1 μL,DNA 1 μL,去離子水補(bǔ)足25 μL;將溶解劑、引物、探針和去離子水以混合溶液形式加入到含凍干粉的反應(yīng)管中,混勻離心,將DNA模板加到反應(yīng)管中,反應(yīng)管蓋上加入激活劑,上下顛倒混合瞬時離心后,立刻將反應(yīng)管放置在恒溫?zé)晒鈾z測儀上讀取熒光值,檢測時間為30 s每一周期。反應(yīng)條件為38 ℃條件下反應(yīng)20 min。以重組質(zhì)粒DAdV-18T為模板,以蒸餾水為陰性對照,對該方法的引物對組合,引物濃度,反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化,判定結(jié)果以熒光值最高和檢測時間最短選出最佳的檢測條件。操作如下:篩選引物組合,引物進(jìn)行兩兩組合作為檢測的引物對,篩選的引物對在2個濃度梯度(0.5 μmol/L、1 μmol/L),確定最佳引物濃度;最后優(yōu)化反應(yīng)溫度,設(shè)置3個反應(yīng)梯度溫度(38 ℃、40 ℃和42 ℃)。

1.6 DAdV快速檢測方法的特異性 以重組質(zhì)粒DAdV-H-18T、DHV、DPV、DTMUV、MDPV和DRV核酸為模板,同時以RNase水為陰性對照,在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行RPA恒溫快速擴(kuò)增,來評估該方法的特異性。

1.7 DAdV快速檢測方法的敏感性 將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋,選取濃度為1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1copies/μL的5個稀釋度質(zhì)粒,按照優(yōu)化后的RPA條件進(jìn)行該方法的敏感性測定,根據(jù)所得的Ct值,獲得所建立方法的最低檢出拷貝數(shù)。

1.8 DAdV快速檢測方法的重復(fù)性測定 以濃度為1×104、1×103、1×102copies/μL模板進(jìn)行恒溫擴(kuò)增,每個稀釋濃度重復(fù)三次,根據(jù)Ct值計算變異系數(shù),評價該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣本的檢測 對55份臨床樣品進(jìn)行檢測,按照優(yōu)化后的RPA方法,同時基于MGB探針的熒光定量PCR方法[21］進(jìn)行檢測。結(jié)果進(jìn)行分析,比較RPA和qPCR方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增和鑒定結(jié)果 以提取的DAdV-3DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1),與DL2000 DNA Marker進(jìn)行比較,獲得預(yù)期大小約為264 bp明亮目的條帶,陰陽性對照組成立。將目的片段回收后克隆至pMD-18T載體,再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,鑒定陽性菌液(圖2)后提取質(zhì)粒送測序,測序鑒定正確后,命名為DAdV-H-18T。計算該質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.06×1011copies/μL。

M: DL 2000 DNA Marker; 1-3: DAdV-3 amplification

2.2 引物對的篩選 DAdV-3最佳引物組合的結(jié)果如圖3所示,F1/R4陽性所得熒光值為7200,Ct值05∶30,檢測結(jié)果為弱陽性,判斷該組合為在18 min開始非特異性擴(kuò)增,檢測結(jié)果相對較好;F1/R1,F1/R2引物組合陰性起峰較大,檢測結(jié)果為陽性,該組合不成立;F1/R3,F1/R4引物組合陰性起峰小,F1/R3檢測結(jié)果較F1/R4差;因此確定DAdVF1和DAdVR4為最佳引物對,用于后續(xù)實(shí)驗。

1: F1/R1; 2: F1/R2; 3: F1/R3; 4: F1/R4; 5: F1/R1 negative;6: F1/R2 negative; 7: F1/R3 negative; 8: F1/R4 negative

2.3 引物濃度的優(yōu)化 引物濃度梯度分別為0.5和1 μmol/L的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示,1 μmol/L和0.5 μmol/L出峰時間一致,Ct值為08∶00,1 μmol/L引物濃度的熒光值為5400;0.5 μmol/L的熒光值為7200;根據(jù)Ct值小和熒光值高的原則篩選,故最佳引物濃度選擇0.5 μmol/L。

A:1 μmol/L;B:0.5 μmol/L;1: Positive control;2: Negative control

2.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化 設(shè)置溫度梯度為38 ℃、40 ℃、42 ℃,優(yōu)化結(jié)果如圖5所示,38 ℃和40 ℃出峰時間最早,Ct值為04:00,38 ℃較40 ℃的熒光值高為6700,42 ℃熒光值最低為5600,Ct為07∶30,故最佳反應(yīng)溫度為38 ℃。

A:38 ℃;B:40 ℃;C:42 ℃;1: Positive control;2: Negative control

2.5 特異性和敏感性試驗結(jié)果 特異性實(shí)驗結(jié)果如圖6所示,該方法只擴(kuò)增出DAdV-3核酸,其他病毒核酸均為陰性,說明所建立的方法具有良好的特異性。敏感性實(shí)驗結(jié)果如圖7所示,該方法最低能夠檢測到1 copy/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1:103 copies/μL;2:Negative control;3:DHV;4:DPV;5:MDPV;6:DRV;7:IBDV;8:DTMUV

1:103 copies/μL;2:102copies/μL;3:101 copies/μL;4:1 copies/μL;5:10-1copies/μL;6～7:Negative control

2.6 重復(fù)性實(shí)驗 選取三種不同拷貝數(shù)(104、103、102copies/μL)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板,每個拷貝數(shù)為三個重復(fù)來驗證該方法的重復(fù)性,結(jié)果如圖8所示,拷貝數(shù)為104copies/μL時Ct值為07∶00、07∶00、07∶30;拷貝數(shù)為103copies/μL時Ct值為07∶30;拷貝數(shù)為102copies/μL時Ct值為07∶00、07∶00、06∶30。三個重復(fù)Ct值相差不大,該方法的重復(fù)性良好。

A:模板拷貝數(shù)為104 copies/μL;B:模板拷貝數(shù)為103 copies/μL;C:模板拷貝數(shù)為102 copies/μL;1～3:陽性模板;4:陰性對照A:104 copies/μL;B:103 copies/μL;C:102 copies/μL;1～3:Positive control;4:Negative control

2.7 臨床樣本的檢測結(jié)果 對收集的55份臨床樣本同時采用所建立的RPA和qPCR進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,RPA陽性率為65.4%,qPCR的陽性率為50.9%,兩種方法的符合率為92.7%(表2)。

3 討論與結(jié)論

2014年以來,我國廣東省番鴨發(fā)生肝腫脹,壞死及不同程度的死亡為特征的疾病,引起該疾病的病原是新型腺病毒DAdV-3。DAdV-3給我國鴨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害,因此建立快速檢測方法是控制DAdV-3感染的有效措施之一。本試驗針對DAdV-3 Hexon的基因序列設(shè)計了2對特異性引物與特異性探針,成功建立了RPA恒溫快速檢測方法。通過對其檢測條件的優(yōu)化,該方法能在38 ℃、18 min條件下檢測到病毒DNA最低含量為1 copy/μL。并且該方法對DAdV-3具有良好的特異性,能準(zhǔn)確的檢測出DAdV-3,并不會對其他鴨病病原產(chǎn)生交叉反應(yīng)。該方法的重復(fù)性實(shí)驗結(jié)果均表明該方法有良好的重復(fù)性。將該方法與qPCR方法同時對DAdV-3臨床樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示該方法與qPCR符合率可達(dá)92.7%。

根據(jù)已報道的MGB TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR方法,比較了兩種方法的敏感性,探針法最低檢測線55拷貝,RPA的敏感性高于MGB TaqMan探針法55倍,探針法檢測時間較長,依賴昂貴設(shè)備,不適合于現(xiàn)場檢測;RPA只需一對引物和探針,檢測時間18 min,極大縮短了現(xiàn)場檢測時間。臨床檢測結(jié)果顯示,RPA陽性率為65.4%大于qPCR的陽性率50.9%。本研究建立的DAdV-3 RPA方法[22］的優(yōu)點(diǎn)如下:首先RPA引物探針能在5～8個錯配的情況下保持實(shí)驗性能不受影響,而qPCR引物探針出現(xiàn)錯配會導(dǎo)致探針失效;其次,RPA檢測溫度在38 ℃～42 ℃下就能進(jìn)行,不需要昂貴的儀器。相比PCR方法,省去了熱循環(huán)過程和昂貴儀器的使用;第三,檢測試劑以凍干粉的形式保存,比其他PCR試劑更穩(wěn)定,更容易運(yùn)輸。

本實(shí)驗建立的DAdV-3RPA恒溫快速檢測方法特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便、快速,為現(xiàn)場快速檢測DAdV-3提供有力工具。