牛 蓉,秦麗波*,李遠恒,周蘭蘭, 孫志文

(1.河南宏信檢測技術(shù)有限公司農(nóng)產(chǎn)食品檢測中心,河南南陽 473000;2.牧原食品股份有限公司,河南南陽 473000;3.北京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,北京 100000)

四環(huán)素類屬于廣譜抗生素,對革蘭氏陽性和陰性細菌、立克次氏體等均有抑菌作用[1-2］,其作用機制主要是和30S核糖體亞基的末端結(jié)合,從而干擾細菌蛋白質(zhì)的合成[3］。常用的四環(huán)素類主要有四環(huán)素、金霉素、土霉素、多西環(huán)素等,該類藥物在畜禽養(yǎng)殖過程中被廣泛作為藥物添加劑使用,用于防止腸道感染和促生長[4］,但長期使用甚至濫用則會導致藥物在動物體內(nèi)滯留或蓄積,并以殘留的方式進入人體及生態(tài)環(huán)境,從而危害人體健康及生態(tài)環(huán)境[5］。因此四環(huán)素類藥物的殘留監(jiān)控尤為重要。目前,四環(huán)素類藥物的殘留分析的資料較多[6-8］,主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[9-10］。本研究參考《GB 31658.6-2021 食品安全國家標準 動物性食品中四環(huán)素類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》中四環(huán)素類藥物的測定方法[11］,并在其基礎上進行了改進優(yōu)化,擬建立豬肉及豬肝中的四環(huán)素、土霉素、金霉素及多西環(huán)素這四種藥物殘留量測定的高效液相色譜法,為國家獸藥殘留監(jiān)控體系提供更為可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器及設備 高效液相色譜儀:E2695,配2489紫外檢測器,美國沃特世公司;電子天平:MS105DU,感量0.01 mg,德國梅特勒托利多公司;電子天平:HZF-A200,感量0.01 g,福州志華電子有限公司;多管混勻儀:UMV-2,北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;高速冷凍離心機:CH160R,湖南湘儀離心機儀器有限公司;氮吹儀:NGB-1024,萊譜(北京)科技有限公司;固相萃取裝置:24位,上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 藥品及材料 鹽酸四環(huán)素:含量98.00%,批號5352101,壇墨質(zhì)檢;土霉素鹽酸鹽:含量89.62%,批號G1125763, 德國Dr.Ehrenstorfer公司;金霉素鹽酸鹽:含量92.90%,批號1112164,德國Dr.Ehrenstorfer公司;鹽酸多西環(huán)素:含量98.00%,批號1116543,德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈:色譜級,美國天地有限公司;三氟乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、草酸、硫酸、鎢酸鈉:分析級,國藥集團化學技術(shù)有限公司;HLB固相萃取柱:規(guī)格500 mg/6 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司;LCX固相萃取柱:規(guī)格500 mg/6 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 標準儲備溶液 精密稱定鹽酸四環(huán)素、土霉素鹽酸鹽、金霉素鹽酸鹽、鹽酸多西環(huán)素標準品適量(相當于四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素各10 mg),用甲醇溶解并稀釋定容至不同10 mL容量瓶內(nèi),配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液。-18 ℃以下保存,有效期為1個月。

1.3.2 混合標準中間液 精密量取土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素標準儲備液各0.1 mL, 于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,配制成濃度為10 μg/mL的混合標準中間液。2～8 ℃保存?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 檸檬酸溶液 取檸檬酸21.01 g,用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3.4 磷酸氫二鈉溶液 取無水磷酸氫二鈉71.63 g,用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3.5 Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0) 取檸檬酸溶液1000 mL、無水磷酸氫二鈉溶液625 mL, 混勻,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.0±0.05。

1.3.6 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液 取乙二胺四乙酸二鈉60.5 g,加Mcllvaine緩沖溶液1625 mL,溶解,混勻。

1.3.7 草酸溶液(0.01 mol/L) 取草酸1.26 g,用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3.8 三氟乙酸溶液(0.01 mol/L) 取三氟乙酸0.8 mL,用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3.9 硫酸溶液 取硫酸1.85 mL,用水溶解并稀釋至100 mL。

1.3.10 鎢酸鈉溶液 取鎢酸鈉7 g,用水溶解并稀釋至100 mL。

1.3.11 草酸溶液(1 mol/L) 取草酸12.6 g,用水溶解并稀釋至100 mL。

1.3.12 草酸-乙腈溶液 取草酸溶液(1 mol/L)20 mL,用乙腈溶解并稀釋至100 mL。

1.3.13 磷酸二氫鈉溶液(8 mmol/L) 取磷酸二氫鈉96 mg,用水溶解并稀釋至100 mL,pH為5.0。

1.4 實驗方法

1.4.1 提取 稱取試料5 g(準確至±0.02 g),加Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL,渦旋1 min,振蕩10 min,加硫酸溶液5 mL、鎢酸鈉溶液5 mL, 渦旋1 min,-5 ℃下8500 r/min離心5 min,取上清液。殘渣用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL、10 mL各提取1次,合并上清液,中性濾紙過濾,備用。

1.4.2 凈化 HLB柱依次用甲醇、水和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液各5 mL活化。備用液過柱,待全部備用液流出后,依次用水、5%甲醇溶液各10 mL淋洗,抽干30 s,用甲醇6 mL洗脫,收集洗脫液于刻度試管中,加2 mL 8 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 5.0),混勻,過甲醇5 mL、水5 mL活化的LCX柱,待全部液體流出后,用水、甲醇各5 mL淋洗,抽干1 min,草酸-乙腈溶液6 mL洗脫,收集洗脫液,于40 ℃水浴氮氣吹至0.5～1.0 mL,用草酸溶液(0.01 mol/L)稀釋至2.0 mL,微孔濾膜過濾,高效液相色譜測定(上機溶液應在24 h內(nèi)完成測定)。

1.4.3 液相色譜條件 色譜柱:安捷倫ZORBAX-Extend-C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測波長:340 nm;流動相:A為0.01 mol/L三氟乙酸溶液,B為乙腈(梯度洗脫程序見表1);流速:1.0 mL/min;進樣量:50 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.4 標準曲線繪制 精密量取混合標準中間液適量,用草酸溶液(0.01 mol/L)稀釋成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的系列混合標準液,供高效液相色譜測定。以測得的峰面積為縱坐標,對應的標準溶液濃度為橫坐標,繪制標準曲線,求回歸方程和決定系數(shù)。

1.4.5 檢測限及定量限 分別稱取豬肉及豬肝空白樣品各5 g,準確加入一定體積的混合標準中間液,按照1.4項對應實驗條件進行樣品前處理并上機測定,按3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算方法的檢測限和定量限。

1.4.6 回收率及精密度 取空白豬肉及豬肝樣品各54份,分為3批,每批18份,參照GB/T 27404-2008,以定量限和最高殘留限量為標準,添加3個不同濃度,每個濃度點6個平行樣品,按照1.4項對應實驗條件進行樣品前處理并上機測定,計算回收率及相對標準偏差,其中采用同批內(nèi)相同添加濃度的6個平行樣品回收率數(shù)據(jù)計算日內(nèi)相對標準偏差,采用3批平均回收率數(shù)據(jù)計算日間相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件優(yōu)化 選擇6份空白豬肉,分A組和B組,每組3份樣品,進行100 μg/kg的加標,按照1.4.1項和1.4.2項中HLB小柱凈化過程操作,A組經(jīng)HLB凈化后的甲醇洗脫液直接過LCX小柱,B組經(jīng)HLB凈化后的甲醇洗脫液用磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH后過LCX小柱,將兩組經(jīng)LCX小柱凈化后的樣品氮吹復溶后上機測定,比對四環(huán)素類藥物的平均回收率。結(jié)果顯示,B組平均回收率明顯高于A組(如圖1所示),因此最終凈化條件選擇B組對應條件,詳細操作見1.4.2項。

圖1 不同凈化pH下四環(huán)素類藥物的回收率

2.2 檢測波長優(yōu)化 本研究測定了5 μg/mL四環(huán)素類混合標準溶液在300～400 nm下的響應值,發(fā)現(xiàn)在340 nm波長下,四種藥物響應最高(如圖2所示),因此,選擇340 nm為最佳波長。

圖2 四環(huán)素類標準溶液(5 μg/mL)在不同波長下的響應值

2.3 標準工作曲線 按照1.4.4項配制標準曲線并檢測,結(jié)果顯示四種藥物在0.05～5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好,具體回歸方程和決定系數(shù)見表2。

表2 回歸方程及決定系數(shù)

2.4 檢測限及定量限 按照1.4.5項中相關步驟,依據(jù)3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算豬肉及豬肝對應檢出限及定量限,得出四種藥物在豬肉中檢測限為20 μg/kg,定量限為50 μg/kg;在豬肝中檢測限為50 μg/kg,定量限為100 μg/kg。

2.5 回收率及精密度 按照1.4.6項中規(guī)定的樣品數(shù)量及加標標準,空白豬肉樣品加標濃度分別為50、100、200 μg/kg;空白豬肝樣品加標濃度分別為100、200、600 μg/kg;以上樣品按照1.4.1項及1.4.2項中前處理步驟處理后上機測定,計算回收率及RSD,其回收率水平及RSD值均符合《GB/T 27404-2008實驗室質(zhì)量控制》對應技術(shù)標準,具體結(jié)果見表3。

表3 豬肉和豬肝中四環(huán)素類藥物的回收率及精密度

2.6 穩(wěn)定性 將加標濃度為100 μg/kg的空白豬肉樣品按照本實驗條件進行處理,將處理后的樣品溶液分別在0、12、24、48、72 h上機測定,對比四種藥物的回收率。結(jié)果顯示,四環(huán)素類藥物隨著時間的變化含量逐漸降低,在24 h內(nèi)藥物損失率均低于5%,24 ～48 h內(nèi),藥物含量發(fā)生了明顯降低,48 h時四種藥物損失率均高于15%(表4),因此處理完的樣品需在24 h內(nèi)測定完畢,以確保檢測結(jié)果的準確性。

表4 穩(wěn)定性測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測方法的選擇 獸藥殘留檢測的方法目前主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、微生物法等[12］。微生物法操作簡便、價格低廉、不需要精密儀器,缺點是不能區(qū)分具體的藥物種類,難以進行定量檢測。酶聯(lián)免疫法成本較低,靈敏度相對較高,但在多殘留檢測方面存在一定的局限性,且檢測精準度不夠高,檢測樣品假陽性或假陰性概率較色譜法高。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、分析速度快且能夠精準定量[13］,但儀器昂貴,影響因素較多,且受樣品基質(zhì)效應的影響,往往需要采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。高效液相色譜法具有檢測成本較低、無明顯基質(zhì)效應、可準確定量等特點[14］,適用范圍較廣。因此,本研究選擇高效液相色譜法測定豬肉及豬肝中四環(huán)素類藥物的殘留量。

3.2 凈化條件的優(yōu)化 LCX固相萃取柱屬于離子交換型固相萃取柱,樣品溶液過柱前需調(diào)節(jié)pH至合適范圍內(nèi),但《GB 31658.6-2021》中經(jīng)HLB凈化后的洗脫液過LCX小柱前未調(diào)節(jié)pH,即四環(huán)素類藥物離子化不充分,目標物與LCX小柱的磷酸官能團結(jié)合效率低,導致目標物損失,回收率偏低[15］。本試驗對比了HLB凈化后的洗脫液上LCX小柱前調(diào)節(jié)pH及不調(diào)節(jié)pH兩種條件,發(fā)現(xiàn)不調(diào)節(jié)pH直接過LCX小柱,四環(huán)素類藥物的回收率均低于60%;經(jīng)磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH后再過LCX小柱,四環(huán)素類藥物的回收率明顯提高,均在80%以上。因此,本方法最終選擇使用磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)HLB凈化后的洗脫液pH,以提高方法回收率,保證檢測結(jié)果準確性。

3.3 色譜條件的優(yōu)化 《GB 31658.6-2021》中四環(huán)素類藥物檢測波長為350 nm,有部分報道顯示土霉素、四環(huán)素和金霉素的檢測波長分別為355 nm和365 nm[16-17］。本試驗考察了300 ～ 400 nm范圍內(nèi)四環(huán)素類藥物的響應值,發(fā)現(xiàn)選擇340 nm波長時,各藥物響應最高。因此,選擇340 nm為本方法最佳波長。

本研究建立了一種高效液相色譜法同時豬肉及豬肝中四種四環(huán)素類藥物獸藥殘留檢測方法。通過各項技術(shù)參數(shù)的考察驗證,本方法無基質(zhì)效應、重復性好、準確度高且精密度良好,滿足豬肉及豬肝中四環(huán)素類藥物殘留量的檢測,可為動物性食品中四環(huán)素類藥物的殘留監(jiān)控提供檢測依據(jù)。