郁浩勝,謝凌峰,陳天琪,李冰心,曹 楠,付新亮,田允波,許丹寧,李婉雁

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院,廣州 510225)

鵝由于天性喜水,鵝在我國的養(yǎng)殖模式都依賴于水體,此種養(yǎng)殖模式存在很多弊端,糞便等排泄物被排放至水體后,隨著養(yǎng)殖時間的延長以及糞便的積累,水體中革蘭氏陰性菌利用糞便中氮磷等物質(zhì)不斷繁殖,在細(xì)菌死亡后釋放內(nèi)毒素(LPS)[1］。由于天氣和養(yǎng)殖環(huán)境等因素造成水體環(huán)境惡化,不能得到及時處理,形成污染源。水體中的細(xì)菌和LPS附著于粉塵顆粒漂浮在空氣中,通過呼吸和采食進(jìn)入雛鵝體內(nèi),在體內(nèi)堆積無法完全排出,從而對機(jī)體造成不良影響。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分是LPS。在生產(chǎn)中,革蘭氏陰性菌感染會導(dǎo)致生理機(jī)能紊亂,免疫力降低引起免疫抑制等不良影響。脾臟是外周免疫器官,脾臟具有多種免疫細(xì)胞和因子,它們之間相互作用,相互調(diào)節(jié),既可通過吞噬作用完成集體非特異性免疫,又可通過B、T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮特異性免疫功能[2, 3］。T-bet和GATA-3分別表達(dá)于Th1和Th2細(xì)胞,T-bet和GATA-3的表達(dá)水平代表了Th1和Th2的水平;通過研究Th1和Th2的水平,達(dá)到治療某些疾病的作用[4-5］。LPS的損傷機(jī)制主要作用上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等靶細(xì)胞,使細(xì)胞表面分子異常,導(dǎo)致細(xì)胞的功能性損傷;或者激活免疫細(xì)胞,使免疫細(xì)胞分泌大量炎性介質(zhì)引起炎癥的發(fā)生。

近些年報(bào)道,中藥提取物對畜禽的免疫方面有作用[6-7］。白術(shù)多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalakoidz,PAMK)是中藥白術(shù)的主要活性成分,具有綠色天然無毒無公害等作用特點(diǎn)。已有研究證實(shí),白術(shù)多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,維持機(jī)體免疫平衡,活化增殖免疫細(xì)胞的作用。前期研究表明,白術(shù)多糖具有維持機(jī)體免疫平衡,活化增殖免疫細(xì)胞等調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用,然而白術(shù)多糖對于LPS引起的雛鵝脾臟損傷的研究還有待完善,因此本試驗(yàn)將對雛鵝腹腔注射LPS制備雛鵝炎癥模型,試驗(yàn)期間通過飼料拌喂白術(shù)多糖來進(jìn)行治療,使用HE染色法、熒光定量PCR等試驗(yàn)方法,研究白術(shù)多糖對雛鵝脾臟的影響,為進(jìn)一步應(yīng)用在生產(chǎn)實(shí)踐中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 1日齡馬崗鵝80羽(公母各半),購自清遠(yuǎn)金羽豐鵝業(yè)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 白術(shù)多糖(CY201216),購自楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司,純度為95%,;脂多糖(L2880-100MG)購自美國Sigma Chemical公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 Trizol(1559602)購自美國Ambion公司;反轉(zhuǎn)錄試劑(Rr036A)購自日本TaKaRa;實(shí)時定量PCR染料2×RealStar Green Fast Mixture with ROX Ⅱ(A304-10)購自北京康潤誠業(yè)科技有限公司;熒光定量PCR儀器(ABI PRISM 7500 新加坡);光學(xué)顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)選用80羽1日齡健康馬崗鵝,隨機(jī)分為對照組(CON組)、白術(shù)多糖(PAMK組)、脂多糖(LPS組)、白術(shù)多糖+脂多糖組(PAMK+LPS組),每組20羽。預(yù)飼3 d后,PAMK組和PAMK+LPS組飼喂添加400 mg/kg的白術(shù)多糖(純水充分溶解后均勻噴灑在飼料表面后烘干)至試驗(yàn)結(jié)束。在24、26日齡時各進(jìn)行一次注射給藥,CON組和PAMK組雛鵝腹腔注射0.5 mL生理鹽水;LPS組和LPS+PAMK組雛鵝腹腔注射2 mg/kg·BW LPS溶液,在26日齡注射結(jié)束1 h后,根據(jù)《仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利要求》宰殺雛鵝并采集脾臟。本試驗(yàn)飼養(yǎng)期間均在仲愷教學(xué)試驗(yàn)基地專人飼養(yǎng),雛鵝自由采食和飲水全程飼養(yǎng)、免疫程序及環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)均按《馬崗鵝肉鵝飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范》(廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 44/T 1595-2015)執(zhí)行。藥物注射劑量參考前人研究結(jié)果[9］。

1.2.2 HE染色 每組隨機(jī)抽取3羽雛鵝頸動脈放血處死后采集脾臟,4 %多聚甲醛中固定,制作常規(guī)石蠟組織切片,進(jìn)行HE染色。利用光學(xué)顯微鏡觀察脾臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài),應(yīng)用Photoshop軟件計(jì)算動脈周圍淋巴鞘面積。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 根據(jù)熒光定量PCR對引物要求,使用NCBI在線資源查找基因序列,設(shè)計(jì)合成引物,每組取6羽雛鵝并摘取脾臟,冷凍研磨脾臟組織,并進(jìn)行RNA的提取,提取的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Rr036A)說明書進(jìn)行操作,得到cDNA。根據(jù)實(shí)時定量PCR染料(A25742)說明書配制反應(yīng)體系,在實(shí)時熒光定量PCR儀器中檢測,以β-actin作為內(nèi)參基因,應(yīng)用2-ΔΔct法計(jì)算出目的基因的mRNA表達(dá)水平。本試驗(yàn)的基因引物序列見表2,由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 小鵝基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))%

表2 熒光定量PCR引物

預(yù)混料為每千克日糧提供VA 5 000 IU,VD3 2 000 IU,VE 40 mg,VB1 2.5 mg,VB2 4 mg,VB6 4 mg,生物素biotin 0.2 mg,VB12 12 μg,泛酸鈣cal￣cium pantothenate 15 mg,Fe 90 mg,Cu 8 mg,Zn 70 mg,Mn 90 mg,Se 0.3 mg。

粗蛋白為實(shí)測值,其余營養(yǎng)水平為計(jì)算值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 脾臟動脈周圍淋巴鞘面積、細(xì)胞因子等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均使用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(MEAN±SEM)”表示,P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMK對LPS處理下雛鵝脾臟組織形態(tài)的影響 由圖1可知,與CON組和PAMK組相比,LPS組的脾臟細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞損傷萎縮,形態(tài)各異,細(xì)胞數(shù)目減少并伴有凋亡現(xiàn)象,與LPS組相比,LPS+PAMK組的細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞形態(tài)正常。與CON組和PAMK組相比,LPS組的動脈周圍淋巴鞘面積顯著縮小(P<0.05),LPS+PAMK組的動脈周圍淋巴鞘面積無顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明PAMK能有效緩解LPS造成的脾臟組織損傷。

2.2 PAMK對LPS處理下雛鵝脾臟組織中炎性細(xì)胞因子的mRNA相對表達(dá)量的影響 IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用熒光定量PCR檢測IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示,LPS組IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著高于CON組和PAMK組(P<0.05),但LPS+PAMK組與LPS組相比,IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);LPS組IL-4表達(dá)水平高于CON組(P>0.05),但LPS+PAMK組與LPS組相比,IL-4表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);LPS組TNF-α表達(dá)水平低于CON組(P>0.05),但LPS+PAMK組與LPS組相比,TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);LPS組IFN-γ表達(dá)水平顯著低于CON組(P<0.05),但LPS+PAMK組與LPS組相比,IFN-γ表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明,PAMK能夠顯著下調(diào)脾臟組織中炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量,維持炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平的相對穩(wěn)定。

圖中數(shù)據(jù)柱上方的字母用于表示組間差異,字母相同則表示兩組間沒有差異(P>0.05),若字母不同則表示兩組間存在顯著性差異(P<0.05)。The letters above the data column in the figure are used to indicate inter group differences. If the letters are the same, it means there is no difference between the two groups (P>0.05). If the letters are different, it means there is a significant difference between the two groups (P<0.05).

2.3 PAMK對LPS處理雛鵝脾臟GATA-3與T-bet表達(dá)量變化 圖3結(jié)果顯示,LPS組GATA-3表達(dá)水平顯著低于CON組和PAMK組(P<0.05),但LPS+PAMK組與LPS組相比,GATA-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);LPS組T-bet表達(dá)水平顯著低于CON組(P<0.05),但LPS+PAMK組與LPS組相比,T-bet表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明,PAMK能調(diào)節(jié)LPS處理雛鵝脾臟中GATA-3、T-bet的mRNA表達(dá)量,使其接近對照水平。

圖3 PAMK對LPS處理雛鵝脾臟GATA-3與T-bet表達(dá)量變化的影響

3 討論與結(jié)論

脾臟是鵝體內(nèi)最大的外周免疫器官,其主要功能主要是通過清除免疫過程中機(jī)械損傷或異常的細(xì)胞來保護(hù)機(jī)體以降低各種病原的侵害,脾臟也能產(chǎn)生各種炎性因子調(diào)控機(jī)體免疫平衡。90%的血液流經(jīng)脾臟,在抗感染和獲得性免疫應(yīng)答方面有重要作用,同時脾臟也是細(xì)病原體對機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制作用的靶器官。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,通過與機(jī)體細(xì)胞表面結(jié)合觸發(fā)多種信號通路并釋放細(xì)胞因子,是導(dǎo)致全身炎癥和多器官功能衰竭的重要發(fā)病機(jī)制。LPS是通過激活體內(nèi)的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞,這些細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子激活信號通路,引發(fā)細(xì)胞損傷導(dǎo)致器官衰竭。LPS被大量實(shí)驗(yàn)用作建立細(xì)菌感染的炎癥動物模型。[10］。研究認(rèn)為脾臟實(shí)質(zhì)中含有大量T、B淋巴細(xì)胞,淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要的細(xì)胞群,主要參與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞免疫功能的作用。因此,雛鵝脾臟的生長發(fā)育及組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化,均對雛鵝的免疫功能研究有重要意義。

本研究表明,LPS組雛鵝脾臟的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,形態(tài)各異,細(xì)胞間排列疏松,細(xì)胞數(shù)目減少,并有凋亡現(xiàn)象,組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞損傷導(dǎo)致炎癥的發(fā)生;動脈周圍淋巴鞘主要聚集大量T細(xì)胞,HE染色結(jié)果顯示,脾臟組織動脈周圍淋巴鞘面積顯著縮小,顯著影響了雛鵝脾臟組織結(jié)構(gòu),表明細(xì)胞免疫功能降低,造成了嚴(yán)重?fù)p傷,這也說明LPS誘導(dǎo)的雛鵝免疫抑制模型構(gòu)建成功。據(jù)先前研究,在飼糧中添加400 mg/kg的PAMK能夠?qū)C(jī)體起到一定保護(hù)作用[11］,前期結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn),但PAMK對LPS誘導(dǎo)雛鵝炎癥的保護(hù)機(jī)制尚不明確。

本研究表明,LPS通過增加IL-1β、IL-4、IL-6和降低TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子表達(dá)水平從而導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡甚至直接造成炎癥損傷。很多植物性多糖的研究也在證實(shí),在機(jī)體處于炎癥狀態(tài)下,它們可以促使淋巴細(xì)胞增多、改善脾臟組織結(jié)構(gòu)[12, 13］、調(diào)控炎性因子表達(dá)水平和抑制脾臟細(xì)胞的凋亡,從而緩解LPS帶來的影響[14, 15］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,PAMK+LPS組顯著降低了IL-1β、IL-6的表達(dá),顯著增加了TNF-α、IFN-γ的表達(dá),這可能是PAMK調(diào)節(jié)免疫水平和緩解細(xì)胞損傷的途徑之一。

Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫,具有免疫殺傷作用,可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,在特異性自身免疫疾病和抗感染免疫中起重要調(diào)節(jié)作用,T-bet是Th1的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,主要作用包括抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲感染等,在促進(jìn)Th0向Th1分化過程中起決定性作用,T-bet的表達(dá)量升高,可促進(jìn)Th1的分化,抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生,調(diào)節(jié)Th1免疫反應(yīng)[15-18］。Th2主要參與調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng),GATA-3是Th2的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,GATA-3的表達(dá)量升高,促進(jìn)了Th0向Th2的分化,調(diào)節(jié)Th2的免疫反應(yīng)[18, 19］。有報(bào)道指出,GATA-3在機(jī)體造血過程中也有作用[20］。本研究表明,LPS顯著降低了GATA-3和T-bet的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá),白術(shù)多糖顯著上調(diào)了脾臟淋巴細(xì)胞中Th1和Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞因子(TNF-α和IFN-γ)及Th2細(xì)胞因子(IL-4和IL-6)的mRNA表達(dá)。這表明PAMK通過調(diào)節(jié)脾臟中GATA-3和T-bet的表達(dá)量改善了LPS對雛鵝炎癥反應(yīng),維持免疫功能的相對穩(wěn)定。

PAMK可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)炎性因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)緩解LPS誘導(dǎo)的雛鵝脾臟免疫炎癥反應(yīng),并維持脾臟的正常組織結(jié)構(gòu)。