馬秋婷 朱鈺晨 萬小光 洪滔 張鴻 劉志勇 （.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.江西草珊瑚科技有限公司 南昌 33009）

草珊瑚，又名腫節(jié)風(fēng)、接骨木、竹節(jié)茶等，最早以“接骨草”見于《本草拾遺》［1］，是金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，主要分布于長(zhǎng)江流域以南的大部分地區(qū)，如江西、福建、貴州等地，也是閩南道地藥材之一［2］。草珊瑚性味苦、辛、平，歸心、肝經(jīng)，具有清熱涼血、解毒消斑、祛風(fēng)止痛等功效［3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其主要有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，因其毒副作用小、具有較好的消炎止痛等療效［4］。在臨床應(yīng)用中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，常用來治療感冒高熱、瘡瘍膿腫、血熱紫斑、紫癜、燒傷、 風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等疾病［5］。目前，國(guó)內(nèi)以草珊瑚為主要原料生產(chǎn)多種中成藥產(chǎn)品，例如草珊瑚含片、腫節(jié)風(fēng)浸膏、血康口服液、腫節(jié)風(fēng)片等，臨床應(yīng)用廣泛。除藥用以外，草珊瑚在我國(guó)還有悠久的食用歷史，民間有用水沖泡茶飲的習(xí)俗。

草珊瑚中含有多種化學(xué)成分，主要有香豆素類、黃酮類、酚酸類、倍半萜類、大分子蛋白和多糖類等［6］。研究發(fā)現(xiàn)，多糖作為中藥的活性物質(zhì)之一，具有廣泛的藥理活性，因其毒副作用小、功能廣泛、安全性高，被廣泛關(guān)注。據(jù)相關(guān)報(bào)道，草珊瑚多糖是草珊瑚中水溶性成分，為抗免疫性血小板減少性紫癜的有效成分［7］。草珊瑚中一些酸性多糖結(jié)構(gòu)也具有較好的抗炎、抗氧化活性［8］，但相關(guān)研究較少。因此，本次研究通過氧化自由基清除和大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其抗氧化抗炎能力，采用小鼠斷尾止血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其止血能力。

1 儀器和材料

1.1 主要材料與試劑

95%乙醇（西隴化工股份有限公司）；DPPH（源葉生物，批號(hào)：A800764）；ABTS（上海麥克林生化科技有限公司，MB3206）；抗壞血酸（Solarbio，貨號(hào)：A8100）；角叉菜膠（Solarbio，貨號(hào)C8830）；以上試劑純度均為分析純。草珊瑚飲片（江西匯中中藥股份有限公司）；云南白藥（云南白藥集團(tuán)有限公司）；阿司匹林（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)HH.WB22-550-11）；超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠，型號(hào)CQ-250A-DST）；離心機(jī)（Cence 湘儀，型號(hào)TDZ5-WS）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)RE5205）；冷凍干燥機(jī)（美國(guó)LABCONCO 公司）；電子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）；純水儀（型號(hào)Milli-Q-Zntegral 10，江西鼎技科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)BS200S-WEI）；旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)VORTEX-6）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠為SPF 級(jí)昆明種雄性健康小白鼠50 只，體重18～22 g。大鼠為SPF 級(jí)雌性SD 大鼠48 只，體重200～220 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心提供，飼養(yǎng)在江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心SPF 級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)，環(huán)境溫度為20～23 ℃、濕度45%～55%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：SYXK（贛）2022-0002，使用許可證編號(hào)：SCXK（贛）2018-0003，受理編號(hào)：20221129004。本項(xiàng)目全程注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理，遵循3R 原則，項(xiàng)目得到江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 草珊瑚多糖的提取

參照邵佳等［9］的提取方法并稍作修改。取草珊瑚全草飲片30 g，置于圓底燒瓶中，采用水提醇沉法，按提取溫度95 ℃，提取時(shí)間4 h，料液比1∶20回流提取3 次，合并濾液，抽濾，減壓濃縮至體積的1/4，加入3 倍量的95%乙醇，慢加快攪，4 ℃醇沉過夜，棄去上清液，取下層沉淀，3 000 r/min 離心10 min，得多糖沉淀，冷凍干燥，即得草珊瑚粗多糖。

2.2 草珊瑚粗多糖得率的計(jì)算

2.3 草珊瑚多糖的抗氧化能力測(cè)定

2.3.1 草珊瑚多糖DPPH 自由基清除活性 用無水乙醇配置0.05 mg/mL 的DPPH 溶液。多糖樣品用超純水溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的多糖溶液，然后配成質(zhì)量濃度為0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的待測(cè)多糖樣品溶液。取100 μL 多糖樣品與100 μL DPPH 混合液，于517 nm 測(cè)定吸光度，作為樣品組；測(cè)定100 μL 多糖樣品與100 μL 蒸餾水混合液的吸光度，作為空白組；測(cè)定100 μL 蒸餾水和100 μL DPPH 混合液的吸光度，作為對(duì)照組。室溫下避光放置20 min，于517 nm 處測(cè)定吸光度。以抗壞血酸（Vc）作為陽性對(duì)照，平行測(cè)定3 次。按照下列公式計(jì)算DPPH 自由基清除能力。

公式中A樣品組：100 μL 樣品液+100 μL DPPH混合液；A空白組：100 μL 樣品液+100 μL 蒸餾水；A對(duì)照組：100 μL 蒸餾水+100 μL DPPH 混合液。

2.3.2 草珊瑚多糖ABTS 自由基清除活性 根據(jù)Liu等［10］的方法進(jìn)行測(cè)定并稍作修改。配制7 mmol/L ABTS 和4.96 mmol/L 過硫酸鉀等體積混合，在室溫下避光靜置12～16 h，得到ABTS 自由基儲(chǔ)備液。然后用無水乙醇將混合液稀釋至40 倍。多糖樣品用超純水溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的多糖溶液，然后配成質(zhì)量濃度為0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的待測(cè)多糖樣品溶液。于96 孔板中，分別加入不同濃度的多糖樣品溶液50 μL 與150 μL ABTS 混合液，作為樣品組；以150 μL 蒸餾水替代ABTS 混合液，作為空白組；50 μL 蒸餾水與150 μL ABTS 混合液，作為對(duì)照組。避光靜置20 min。在酶標(biāo)儀下測(cè)定734 nm 處的吸光度，平行測(cè)定3 次，按照下列公式計(jì)算每個(gè)濃度的ABTS 清除率（%）。

公式中A樣品組：50 μL 樣品液+150 μL ABTS 混合液；A空白組：50 μL 樣品液+150 μL 蒸餾水；A對(duì)照組：50 μL 蒸餾水+150 μLABTS 混合液。

2.4 草珊瑚體內(nèi)止血實(shí)驗(yàn)

2.4.1 分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為5 組，分別為空白對(duì)照組，陽性組（云南白藥組50 mg/kg），草珊瑚低、中、高劑量組（35、70、140 mg/kg），每組10 只?？瞻讓?duì)照組灌胃同等體積的生理鹽水，給藥組分別灌胃不同濃度的草珊瑚多糖溶液，每日1次，連續(xù)6 d。

2.4.2 小鼠出血時(shí)間的測(cè)定 在第6 次給藥0.5 h后，剪斷小鼠尾尖（約0.3 cm），待血液自行溢出開始計(jì)時(shí)，每隔15 s 用濾紙吸去血滴，直至濾紙吸時(shí)無血停止計(jì)時(shí)，即為出血時(shí)間。

2.5 大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)

2.5.1 分組及給藥 將大鼠分為6 組，每組8 只，分別分為正常對(duì)照組、模型組、陽性組（阿司匹林組）、給藥組（草珊瑚多糖低、中、高劑量組）。正常對(duì)照組和模型組均灌胃同體積的生理鹽水；陽性組給藥劑量為50 mg/kg；給藥組的低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/kg。每日1 次，連續(xù)6 d。

2.5.2 大鼠足腫脹的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開始前，分別在每只大鼠左后足部做標(biāo)記，測(cè)定大鼠未造模前的初始容積。按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行灌胃，記錄灌胃時(shí)間；灌胃1 h 后，將0.1 mL 的1%角叉菜膠分別皮下注入模型組、陽性藥、給藥組大鼠左后足掌中間區(qū)域。分別在注入角叉菜膠0、1、2、4 h 后測(cè)定足趾容積，足腫脹度即為注射角叉菜膠后的足趾容積減去未造模前的初始容積。

語義維基作為多用戶協(xié)作式的知識(shí)管理與交流平臺(tái)，不僅能滿足傳統(tǒng)知識(shí)管理中知識(shí)的共享、應(yīng)用與創(chuàng)新，而且由于其對(duì)知識(shí)的結(jié)構(gòu)化表達(dá)，使得機(jī)器能夠在一定程度上理解信息的含義，在概念的分類、知識(shí)的推理等方面都有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，提高了知識(shí)管理的靈活性和智能性。隨著語義維基技術(shù)的不斷發(fā)展，基于該平臺(tái)的知識(shí)管理應(yīng)用將會(huì)越來越廣泛和深入。

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各項(xiàng)指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)所用圖譜均采用Graphprism 9.3.1 軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 草珊瑚多糖得率結(jié)果

根據(jù)以上提取條件，平行測(cè)定3 次，通過計(jì)算得出草珊瑚多糖的平均得率為6.31%。

3.2 草珊瑚多糖抗氧化能力

3.2.1 草珊瑚多糖DPPH 自由基清除活性 結(jié)果顯示，草珊瑚多糖對(duì)DPPH 清除能力隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度在0.6～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)清除能力趨于穩(wěn)定，0.8 mg/mL 時(shí)，為73.97%，雖然沒有達(dá)到維生素C 的清除能力，但草珊瑚多糖對(duì)DPPH 的清除能力仍較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。見圖1。

圖1 DPPH自由基清除能力

3.2.2 ABTS 抗氧化能力 結(jié)果顯示，草珊瑚多糖對(duì)ABTS 清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)劑量依賴型，當(dāng)草珊瑚多糖濃度為0.8 mg/mL 時(shí)其抗氧化能力最高，對(duì)ABTS 的清除率高達(dá)88.76%，接近于維生素C 的自由基清除能力，說明草珊瑚多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力。見圖2。

圖2 ABTS自由基清除能力

3.3 對(duì)小鼠斷尾出血時(shí)間的影響

小鼠予草珊瑚多糖灌胃后，與正常對(duì)照組相比，陽性組出血時(shí)間顯著降低（P＜0.01）；草珊瑚多糖對(duì)小鼠的出血時(shí)間隨著給藥濃度的增加而降低，其中，與正常對(duì)照組相比，草珊瑚多糖中劑量組有顯著性差異（P＜0.05），高劑量出血時(shí)間顯著降低（P＜0.01），而草珊瑚低劑量組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陽性組相比，草珊瑚高劑量組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)小鼠的出血時(shí)間低于陽性組。表明草珊瑚多糖劑量為70 mg/kg 時(shí)，具有較好的止血效果；當(dāng)劑量為140 mg/kg 時(shí)，小鼠的止血效果優(yōu)于陽性組。見表1。

表1 草珊瑚多糖的出血時(shí)間（，n=10）

表1 草珊瑚多糖的出血時(shí)間（，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.4 對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

大鼠注射角叉菜膠后，分別在0、1、2、4 h測(cè)量足趾容積。其中在0、1、2 h 時(shí)，陽性組和給藥組的大鼠足趾容積均有不同程度增高，但在4 h 時(shí)，足腫脹度明顯降低，與模型組相比，草珊瑚高劑量組有顯著性差異（P＜0.05）。草珊瑚低劑量組和中劑量組雖與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在注射角叉菜膠4 h 后，足腫脹度均有不同程度降低。見表2。

表2 各組大鼠致炎后不同時(shí)間足腫脹度的測(cè)量結(jié)果（，n=10） mL

表2 各組大鼠致炎后不同時(shí)間足腫脹度的測(cè)量結(jié)果（，n=10） mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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4 討論

正常情況下，人體自由基產(chǎn)生與清除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。一旦這種平衡被打破，會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如癌癥、糖尿病、心血管疾病等［11-13］，這些疾病的發(fā)生被認(rèn)為與自由基息息相關(guān)。抗氧化劑能夠有效地清除自由基，使機(jī)體免受自由基的損傷，受到廣泛應(yīng)用。目前大多數(shù)抗氧化劑多為人工合成的，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生副作用。因此，開發(fā)安全無副作用的天然抗氧化劑具有重要意義。本次試驗(yàn)以DPPH和ABTS 清除能力為指標(biāo)，驗(yàn)證草珊瑚多糖的抗氧化作用。結(jié)果顯示：不同濃度的草珊瑚多糖均可以有效清除DPPH 自由基和ABTS 自由基，其自由基清除率雖低于維生素C，但呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)草珊瑚多糖濃度為0.8 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 的清除能力達(dá)到73.97%，對(duì)ABTS 的清除能力高達(dá)88.76%。

機(jī)體正常止血和凝血機(jī)制與血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纖溶系統(tǒng)及其相互之間的生理性調(diào)節(jié)和平衡息息相關(guān)［14］。在止血試驗(yàn)中，通過斷尾法測(cè)定小鼠出血時(shí)間來評(píng)價(jià)草珊瑚多糖的止血活性。結(jié)果表明，草珊瑚多糖可顯著縮短小鼠出血時(shí)間，高劑量組優(yōu)于陽性對(duì)照組（云南白藥），且作用效果與劑量成正相關(guān)。

草珊瑚多糖是草珊瑚主要的抗炎成分之一［15］，有研究表明通過建立LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型，驗(yàn)證了草珊瑚多糖的體外抗炎作用［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過角叉菜膠致大鼠足腫脹試驗(yàn)建立動(dòng)物急性非特異性炎癥模型，以足趾容積為觀察點(diǎn)，考察草珊瑚多糖的體內(nèi)抗炎效果。結(jié)果表明，高劑量的草珊瑚多糖在注射角叉菜膠4 h 后抑制作用明顯，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05）。前人研究結(jié)果和本次研究結(jié)果均表明草珊瑚多糖具有一定的抗炎作用，可為臨床應(yīng)用草珊瑚多糖治療急性非特異性炎癥等疾病提供試驗(yàn)資料，但其抗炎作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，草珊瑚多糖具有一定的抗氧化和消炎止血作用，可為草珊瑚多糖藥物與功能性食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)，或可開發(fā)成具有消炎止血活性的口腔護(hù)理用品。然而，其相關(guān)作用機(jī)制尚不明確，還需作進(jìn)一步的研究和探討。