顏楠,刁艷君,韓峰,劉家云(空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗科,西安 710032)

關(guān)于獲得性凝血因子Ⅷ(FⅧ)抑制物的來源,一種是非血友病患者產(chǎn)生的抗FⅧ自身抗體,另一種是血友病患者接受外源性凝血因子產(chǎn)品輸注后產(chǎn)生的抗FⅧ同種抗體[1]。抑制物形成受多種因素影響,遺傳和治療因素協(xié)同作用促成抑制物產(chǎn)生,表現(xiàn)為出血不止或出血難止,出血的嚴(yán)重程度主要取決于凝血因子水平[2]。狼瘡抗凝物(Lupus anticoagulants,LAC)是一種抗磷脂抗體,在體外試驗中,LAC可通過拮抗帶負(fù)電荷的磷脂或磷脂-蛋白質(zhì)復(fù)合物,干擾凝血試劑使凝血時間假性延長,在體內(nèi)LAC則是強烈的促凝物質(zhì),誘導(dǎo)組織因子表達(dá)、干擾纖溶酶原激活物釋放、激活血小板、影響補體活化、抑制蛋白C,使人體呈現(xiàn)病理性高凝狀態(tài),是引發(fā)靜、動脈血栓形成的重要風(fēng)險因素[3-4]。FⅧ抑制物與LAC都會引起活化部分凝血活酶時間(APTT)延長,甚至干擾依賴APTT試劑檢測的內(nèi)源性凝血因子的定量檢測,因此在凝血因子定量檢測時含量均同時減低的患者,需要排除是否存在病理性抑制物的干擾引起的假性減低[5]。通過對內(nèi)源性凝血因子的多梯度稀釋檢測可以辨別FⅧ抑制物與LAC。

1 材料和方法

1.1研究對象 回顧性分析我院2022年2月至2023年2月門診與住院病例。收集FⅧ抑制物陽性致內(nèi)源性凝血因子活性假性減低組6例,均為男性,年齡9～64(40.0±22.6)歲;LAC陽性致內(nèi)源性凝血因子活性假性減低組15例,男1例,女14例,年齡11～60(34.5±15.5)歲。

1.2儀器與試劑 CS5100全自動凝血分析儀(日本Sysmex公司)。APTT、凝血酶原時間(PT)、LAC試劑以及FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性試劑購自德國SIEMENS公司。

1.3方法 清晨空腹抽取靜脈血2.7 mL,枸櫞酸鈉抗凝,1 500×g離心10 min后分離血漿。

FⅧ抑制物組:檢測PT、APTT以及內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性及其稀釋3個梯度后的活性,進(jìn)行APTT糾正試驗,檢測FⅧ抑制物、LAC(LA1/LA2)。

LAC組:分別檢測LAC(LA1/LA2),檢測內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性及其稀釋3個梯度后的活性。

2 結(jié)果

FⅧ抑制物組6例患者APTT延長顯著(見表1)且APTT糾正試驗均不糾正(見表2);內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性均減低,其中FⅧ活性減低最顯著(見表1);經(jīng)3個梯度(1∶2、1∶4、1∶8)稀釋,FⅧ活性稀釋后變化均較小,FⅨ、FⅪ、FⅫ活性稀釋后均恢復(fù)為接近正常水平(見圖1)。FⅧ抑制物結(jié)果均為陽性,LAC(LA1/LA2)檢測結(jié)果均為陰性(見表2)。

表1 FⅧ抑制物組6例患者PT、APTT與內(nèi)源性凝血因子結(jié)果

注:A～F分別為患者1～6。圖1 FⅧ抑制物組6例患者內(nèi)源性凝血因子活性在不同稀釋度下的變化曲線

表2 FⅧ抑制物組6例患者APTT糾正試驗、FⅧ抑制物與LAC結(jié)果

將LAC組15例LAC陽性患者內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性稀釋前后檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且均能恢復(fù)至接近正常水平(見表3)。通過對比FⅧ抑制物組和LAC組稀釋后的FⅧ活性(見圖2),可有效鑒別FⅧ抑制物與LAC。

表3 LAC組患者各內(nèi)源性凝血因子稀釋前后結(jié)果比較

圖2 LAC組與FⅧ抑制物組FⅧ活性不同梯度稀釋檢測對比

3 討論

抑制物的產(chǎn)生可分為遺傳因素和非遺傳因素,遺傳因素是主要因素,后者為次要因素[6]。FⅧ抑制物篩選采用APTT糾正試驗,由于FⅧ抑制物有時間溫度依賴性,因此若APTT即刻被糾正,則需要進(jìn)一步進(jìn)行37 ℃溫育2 h后的糾正試驗[7]。FⅧ抑制物滴度檢測采用改良的Bestheda法[8]。用不同稀釋度的患者血漿與正常血漿等量混合溫育2 h,測定殘余FⅧ活性。能使正常血漿FⅧ活性減少50%時,FⅧ抑制物的含量為1個Bethesda單位,以BU/μL表示[9]。LAC是一種能與帶負(fù)電荷的磷脂或磷脂蛋白復(fù)合物結(jié)合的免疫球蛋白,屬于抗磷脂抗體可干擾依賴磷脂的體外凝血反應(yīng)[10],其機制為血漿中的LAC能中和APTT試劑中的磷脂,導(dǎo)致凝血時間延長[11]。APTT檢測參與的凝血因子主要有FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ,當(dāng)其時間延長時提示內(nèi)源性凝血功能障礙[12]。行標(biāo)中對標(biāo)本的稀釋要求規(guī)定,因子Ⅷ和Ⅸ活性檢測至少應(yīng)進(jìn)行2個稀釋度的檢測[13]。

本研究FⅧ抑制物組中6例患者APTT延長顯著且APTT糾正試驗均不糾正,提示可能有病理抑制物存在。本研究中,內(nèi)源性凝血因子活性均減低,其中FⅧ活性減低最顯著,稀釋不同梯度后檢測,除FⅧ外其他因子均恢復(fù)至接近正常水平;提示可能存在FⅧ抑制物。LAC組中對15例患者的內(nèi)源性凝血因子活性進(jìn)行不同梯度稀釋檢測,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且均能恢復(fù)至接近正常水平。

FⅧ抑制物與LAC均為病理性抗凝物質(zhì),實驗室診斷病理性抗凝物質(zhì)的確證試驗較為復(fù)雜或尚無參考物質(zhì)和參考方法,分析前、分析中諸多因素均可影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,其臨床應(yīng)用效果不是非常理想[14]。通過對凝血因子多梯度稀釋的方法不僅可以排除病理性抗凝物質(zhì)的干擾,甚至可辨別抑制物與LAC。為臨床早期診斷和治療提供依據(jù),同時也是對不能開展FⅧ抑制物與LAC檢測的實驗室的有效補充。