任杰,王競,門劍龍,張鵬(.天津市西青醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津 300380;.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心,天津 30035)

非瓣膜性心房顫動(nonvalvular atrial Fibrillation,NVAF)是引發(fā)急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)的重要風(fēng)險誘因[1],不但可造成血管栓塞,而且在短時間內(nèi)易再次形成血栓,從而導(dǎo)致殘疾或死亡的臨床后果。目前,臨床上對AIS患者血栓復(fù)發(fā)的早期識別能力仍存在明顯不足,尤其缺乏利用生物標(biāo)志物對腦血管缺血事件的預(yù)警研究。在前期研究中,我們通過血管損傷標(biāo)志物對NVAF患者的缺血事件風(fēng)險進(jìn)行了早期預(yù)警的研究發(fā)現(xiàn),血管損傷與患者的臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[2-3]。存在的問題是,現(xiàn)階段可用于臨床的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)較少,尚不能滿足臨床對于NVAF相關(guān)缺血事件風(fēng)險預(yù)警的需求?；诖?本研究對164例NVAF合并AIS患者的血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)和中性粒細(xì)胞肽?；彼崦搧啺泵?(neutrophil peptidylarginine deiminase 4,PAD4)水平進(jìn)行觀察,分析水平變化特征和趨勢,探索兩項(xiàng)指標(biāo)對于NVAF合并AIS患者缺血性事件復(fù)發(fā)的預(yù)警性能和臨床價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 納入2020年8月至2023年2月期間于天津市西青醫(yī)院就診的NVAF合并AIS患者164例為患者組,男71例,女93例,年齡51～83歲,中位年齡67.9歲;入組患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國急性缺血性卒中診療指南2018》[4];入組患者排除重癥感染、惡性腫瘤、心臟手術(shù)史、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝腎疾病和長期服用激素類等藥物,發(fā)病前1個月均未接受抗凝及抗生素治療。入組患者均在發(fā)病4.5 h內(nèi)接受靜脈溶栓。收集入組患者在治療前和接受治療7 d時的外周靜脈血,第2次采集血液樣本后,對入組患者進(jìn)行為期90 d的隨訪,起止時間為2020年8月1日至2023年5月31日,以患者再次發(fā)生AIS及相關(guān)死亡為終點(diǎn)事件(缺血事件復(fù)發(fā)),患者組在隨訪期內(nèi)有25例患者再次發(fā)生AIS,其中6例患者死亡。根據(jù)終點(diǎn)事件,將患者組進(jìn)一步分為缺血事件復(fù)發(fā)組25例,未復(fù)發(fā)組139例。本研究通過天津市西青醫(yī)院倫理委員會審批(批準(zhǔn)文號:XQYYLL-2020-11)。

1.2標(biāo)本采集、處理與檢測 收集入組患者在治療前和接受治療7 d時的外周靜脈血,以2 664×g離心15 min,枸櫞酸鈉抗凝管中的乏血小板血漿樣本用于TM檢測,分離膠促凝管中的血清樣本用于PAD4檢測。采用Shine i2900型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法,廣州萬孚生物公司)測定血漿凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)水平;采用Freedom EVO Clinical免疫分析加樣儀和Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)及PAD4測定試劑盒(武漢酶免科技生物有限公司)檢測血清PAD4水平。上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以M(P25,P75)表示偏態(tài)分布的數(shù)據(jù);以Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比對,以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比對;用Friedman秩和檢驗(yàn)進(jìn)行同組內(nèi)各時間節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)比較;用ROC曲線分析診斷性能;用Logistic回歸進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析;用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析,Cox比例風(fēng)險回歸模型評價TM和PAD4預(yù)測患者90 d內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險的性能;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AIS患者TM和PAD4測定結(jié)果

2.1.1血漿TM測定結(jié)果 見表1。AIS患者組在治療前、后的血漿TM水平均高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U值分別為682.5和2 079.5,P值均<0.001)。

表1 AIS患者血漿TM測定結(jié)果

在治療前和治療后,復(fù)發(fā)組血漿TM水平均高于未復(fù)發(fā)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U值分別為399.0和200.5,P值均<0.001)。

AIS患者治療后血漿TM水平低于治療前(Z=-5.546,P<0.001),未復(fù)發(fā)組治療后血漿TM水平低于治療前(Z=-6.748,P<0.001),復(fù)發(fā)組治療后TM水平與治療前間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.386,P=0.166)。

2.1.2血清PAD4測定結(jié)果 見表2。AIS患者組在治療前、后血清PAD4水平均高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U值分別為27.5和314.5,P值均<0.001)。

表2 AIS患者血清PAD4測定結(jié)果

治療前,未復(fù)發(fā)組血清PAD4水平與復(fù)發(fā)組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=1 370.0,P=0.093)。治療后,復(fù)發(fā)組高于未復(fù)發(fā)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=213.0,P<0.001)

AIS患者治療后血清PAD4水平低于治療前(Z=-7.888,P<0.001),未復(fù)發(fā)組治療后血漿PAD4水平低于治療前(Z=-10.229,P<0.001),復(fù)發(fā)組治療后PAD4水平高于治療前(Z=-3.996,P<0.001)。

2.2TM和PAD4預(yù)測AIS患者90 d隨訪期內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)的ROC 見圖1。治療前,ROC曲線下面積(AUCROC)為0.885(95%CI:0.830～0.941),當(dāng)血漿TM臨界值為13.04 TU/mL時,診斷敏感性為84.0%,特異性為74.1%。治療后,AUCROC為0.909(95%CI:0.860～0.957),當(dāng)血漿TM臨界值為10.52 TU/mL時,診斷敏感性為92.0%,特異性為74.8%。

治療前,AUCROC為0.606(95%CI:0.500～0.711),當(dāng)血清PAD4臨界值為11.45 ng/mL時,診斷敏感性為84.0%,特異性為39.6%。治療后,AUCROC為0.939(95%CI:0.899～0.979),當(dāng)血漿PAD4臨界值為10.00 ng/mL時,診斷敏感性為96.0%,特異性為62.6%。

采用TM聯(lián)合PAD4進(jìn)行評估,結(jié)果顯示,治療前的AUCROC為0.877(95%CI:0.814～0.939);治療后的AUCROC為0.976(95%CI:0.955～0.997)。

2.3AIS患者治療后TM和PAD4水平與臨床病生理因素的多因素Logistic回歸分析 表3顯示,用Logistic回歸進(jìn)行多因素分析,AIS患者治療后的TM、PAD4水平均與性別和血管疾病無顯著相關(guān)性(P>0.05),與充血性心力衰竭和高血壓有顯著相關(guān)性(P<0.05)。

表3 TM和PAD4水平與臨床病生理因素的Logistic多元分析

2.4生存分析 見圖2。與低于臨界值的AIS患者比較,治療后血漿TM水平高于臨界值(10.52 TU/mL)的患者與在90 d隨訪期內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)的累積風(fēng)險概率顯著增高(Log-rankχ2=20.597,P<0.001),治療后血清PAD4水平高于臨界值(≥10.00 ng/mL)的患者在90 d隨訪期內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)的累積風(fēng)險概率顯著增高(Log-rankχ2=5.836,P=0.016),TM聯(lián)合PAD4在90 d隨訪期內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)的累積風(fēng)險概率顯著增高(Log-rankχ2=27.786,P<0.001)。

注:綠色虛線為高于臨界值,藍(lán)色實(shí)線為低于臨界值;A、B、C分別為TM、PAD4、TM聯(lián)合PAD4。圖2 AIS患者在治療后90 d內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)的累積風(fēng)險概率

2.5Cox回歸分析 見表4。對AIS患者進(jìn)行治療后90 d的隨訪,用Cox回歸模型分析TM和PAD4預(yù)測患者缺血事件復(fù)發(fā)的HR值為1.335和1.162,提示單獨(dú)使用TM或PAD4均不能獨(dú)立預(yù)測隨訪期內(nèi)的缺血事件復(fù)發(fā)風(fēng)險。將TM與PAD4聯(lián)合評估,HR值為1.397(P=0.036),表明兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合分析可有效預(yù)測隨訪期內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)風(fēng)險。

表4 Cox回歸分析TM和PAD4預(yù)測AIS患者治療后90 d內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)

3 討論

TM是一種表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的單鏈跨膜糖蛋白,有多個結(jié)構(gòu)域,參與調(diào)控凝血、免疫等多種生物過程,對維持人體器官正常功能具有重要意義[5]。在生理狀態(tài)下,TM通過與凝血酶形成復(fù)合物,激活蛋白C以滅活凝血因子Ⅴa和Ⅷa,下調(diào)凝血酶生成以實(shí)現(xiàn)抗凝效應(yīng)。游離于血漿中的TM是一類結(jié)構(gòu)不完整的可溶性TM片段,其血漿濃度顯著增高多見于嚴(yán)重的血管損傷[6]。中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)是一種由顆粒衍生蛋白修飾的DNA支架組成的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有促炎和抗炎雙重作用,但NETs的過表達(dá)對機(jī)體的損害超過其保護(hù)作用。NETs的抗炎特性與血栓形成密切相關(guān),有研究顯示其過量生成在AIS的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[7],幾乎在所有類型的AIS患者的血栓栓子中均可發(fā)現(xiàn)NETs結(jié)構(gòu),在NVAF合并AIS的致病過程中也發(fā)揮重要作用,同時NETs生成或清除不力對腦卒中后的血管重建和血管修復(fù)產(chǎn)生負(fù)面影響[8]。PAD4是NETs形成的關(guān)鍵酶,在NETs表達(dá)過程中參與誘導(dǎo)組蛋白瓜氨酸化[9],因此血清中PAD4的含量可反映外周血中NETs的生成水平。

本研究顯示,AIS患者發(fā)病的急性期,血漿TM水平顯著增高,提示由于NVAF所致血流動力學(xué)異常引發(fā)較為嚴(yán)重的血管損傷,導(dǎo)致TM從血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面大量脫落到血漿中。進(jìn)一步的分析顯示,在隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)缺血事件的患者,其在治療前階段時血漿TM水平即顯著高于未復(fù)發(fā)的患者;在治療后,隨訪期內(nèi)未復(fù)發(fā)缺血事件患者的血漿TM水平顯著降低,而復(fù)發(fā)缺血事件的患者則與治療前無顯著差異,仍處于高水平。上述特征表明,由于持續(xù)的血管損傷是NVAF患者發(fā)生AIS的重要驅(qū)動因素和病理基礎(chǔ),而高水平的血漿TM則是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志,因此如患者血漿TM持續(xù)處于高水平,提示血管損傷趨勢并未得到緩解。

血清PAD4水平的顯著增高與血管損傷后的NETs相關(guān)炎性過程密切相關(guān)。有研究表明,外周血中的NETs相關(guān)生物標(biāo)志物水平在動脈血管病變時發(fā)生顯著改變,并與病情嚴(yán)重程度、臨床結(jié)局顯著相關(guān)[10]。在研究中發(fā)現(xiàn),血清PAD4水平在AIS發(fā)病的急性期(治療前)顯著增高,在治療后階段,隨訪期內(nèi)未復(fù)發(fā)缺血事件的患者的PAD4水平出現(xiàn)顯著降低,而隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)缺血事件的患者則較治療前水平更高,則進(jìn)一步表明血管壁炎性損害持續(xù)存在,并參與構(gòu)成了血栓前狀態(tài)和缺血事件復(fù)發(fā)的病理基礎(chǔ)。

ROC曲線分析顯示,以治療前的血漿TM水平對隨訪期內(nèi)缺血事件的預(yù)警性能優(yōu)于PAD4;在治療后,TM和PAD4預(yù)測隨訪期內(nèi)缺血事件均具有良好的診斷性能,其原因可能與TM和PAD4對于血管損傷的反應(yīng)機(jī)制不同有關(guān)。在血栓形成的急性期,血管內(nèi)皮的顯著損傷既是血栓形成驅(qū)動因素,同時在血栓形成后仍可進(jìn)一步加重,TM作為敏感反映血管內(nèi)皮受損的標(biāo)志物,其血漿水平變化伴隨疾病發(fā)生發(fā)展的全過程;PAD4作為NETs的標(biāo)志物,雖然在血管壁炎性病變過程中存在上調(diào)表達(dá)的趨勢,但NVAF患者在AIS發(fā)生的急性期,其缺血事件主要為心源性栓子脫落所致,因此PAD4的表達(dá)水平與該階段病理過程的關(guān)聯(lián)性較弱,但在隨訪期內(nèi),PAD4基于其在血管重建過程中的角色,對于缺血事件復(fù)發(fā)的預(yù)警性能略優(yōu)于TM。Logistic回歸分析也顯示,TM和PAD4與充血性心力衰竭和高血壓等臨床因素均有顯著關(guān)聯(lián)性,說明兩項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢受到多種與血管損傷相關(guān)因素的影響和制約,本研究將TM和PAD4進(jìn)行聯(lián)合ROC曲線分析,進(jìn)一步提高了在隨訪期內(nèi)缺血事件的預(yù)警性能。

生存分析和Cox回歸分析結(jié)果顯示,與低于臨界值的患者比較,治療后TM水平或PAD4水平仍高于臨界值的患者與在隨訪期內(nèi)缺血事件復(fù)發(fā)的累積風(fēng)險概率顯著增高,但兩項(xiàng)指標(biāo)的單獨(dú)評估時,其HR值為1.335和1.162(P值均>0.05),提示均不能具有獨(dú)立預(yù)測缺血事件復(fù)發(fā)風(fēng)險的能力。本文將TM與PAD4做聯(lián)合評估,其HR值為1.397(P<0.05),表明兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合分析可有效預(yù)測AIS患者的缺血事件復(fù)發(fā)風(fēng)險。

綜上所述,NVAF并發(fā)AIS患者由于存在嚴(yán)重的血管損傷,其TM和PAD4水平顯著增高,并隨病情發(fā)展而改變,通過對上述兩項(xiàng)指標(biāo)的動態(tài)監(jiān)測和聯(lián)合評估,可有效預(yù)警AIS患者缺血事件復(fù)發(fā)的風(fēng)險,為臨床早期識別和及時干預(yù)提供依據(jù)。