趙佳 趙倩 蘇蔓 胡光磊 郭霞 王振雷 陳莉

河北省血液中心，河北石家莊 050071

本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)無償獻(xiàn)血者進(jìn)行血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)1例ABO血型正反不符標(biāo)本，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ABO等位基因新的變異組合，同時(shí)對(duì)先證者的家系進(jìn)行了調(diào)查分析，更加證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 樣本來源

先證者，女，32歲，無償獻(xiàn)血者，因ABO正反定型不符送本實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)。本研究所有受試者對(duì)進(jìn)一步研究給予了書面知情同意。

2 血清學(xué)檢查

按文獻(xiàn)[1]采用試管法對(duì)先證者及其父親、母親、丈夫、兒子和兩個(gè)弟弟進(jìn)行ABO血型鑒定。試劑包括單克隆抗-A、抗-B標(biāo)準(zhǔn)血清（上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)20220102），抗-H試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)20210917），抗-A1試劑（荷蘭Sanquin公司，批號(hào)8000456917），抗-AB試劑（德國(guó)CE-IMMUNDIAGNOSTIKA公司，批號(hào)：OABM101-4），反定型紅細(xì)胞（美國(guó)Immucor公司，批號(hào)：115465C）。

3 基因組DNA提取

采用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，批號(hào)：Y1105）提取先證者及其父親的DNA ，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

4 基因測(cè)序

由北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司對(duì)先證者及其父親兩個(gè)樣本進(jìn)行ABO E1-E7外顯子測(cè)序。試劑包括濃縮dNTP Buffer（天津秀鵬生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：k221217001），Taq酶（天津秀鵬生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：A23980）。PCR儀采用杭州博日Life ECO，基因測(cè)序采用美國(guó)ABI公司的3730 DNA測(cè)序儀。測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列ABO*A1.01序列比較，確定突變位點(diǎn)。

結(jié) 果

1 ABO正反定型結(jié)果

先證者及其父親、母親、丈夫、兒子和兩個(gè)弟弟的血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果如表1所示，先證者及其父親均表現(xiàn)為正反定型不符。

表1 先證者及6名家系成員的血清學(xué)鑒定結(jié)果

2 樣本測(cè)序結(jié)果

測(cè)序后結(jié)果與ISBT（International Society of Blood Transfuion，國(guó)際輸血協(xié)會(huì)）網(wǎng)站“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”比對(duì)。根據(jù)血清學(xué)結(jié)果以及遺傳學(xué)規(guī)律可推測(cè)出突變所發(fā)生的單鏈。先證者測(cè)序結(jié)果與ABO*A1.01序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)單鏈1出現(xiàn)c.1A＞G；c.467C＞T；c.903C＞T共3個(gè)突變；單鏈2出現(xiàn)c.261delG共1個(gè)突變，與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)后判定為等位基因ABO*O.01.01。先證者父親 測(cè)序結(jié)果與ABO*A1.01序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)單鏈1出現(xiàn)c.1A＞G；c.467C＞T；c.903C＞T共3個(gè)突變；單鏈2 出現(xiàn)c.106G＞T；c.188G＞A；c.189C＞T；c.220C＞T；c.261delG；c.297A＞G；c.646T＞A；c.681G＞A；c.771C＞T；c.829G＞A共10個(gè)突變，與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)后判定為等位基因ABO*O.01.02（表2，圖1）。

圖1 先證者家系成員ABO表型、基因型

表2 先證者及其父親的測(cè)序結(jié)果

結(jié)合血清學(xué)結(jié)果可以推測(cè)，先證者及其父親的A基因鏈第1外顯子發(fā)生了1A＞G的突變，第7外顯子發(fā)生了467C＞T和903C＞T的突變，可見先證者突變的A基因遺傳自父親，測(cè)序峰圖如圖2所示。ISBT數(shù)據(jù)庫中暫未檢索到此種組合突變型的基因型?！癗ames for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”顯示ABO*Aw33可出現(xiàn)c.467C＞T和c.543G＞T的突變，ABO*Aw42可出現(xiàn)c.467C＞T和c.905A＞G的突變，ABO*Aw43可出現(xiàn)c.467C＞T和c.721C＞T的突變。

圖2 先證者及其父親ABO基因部分突變位點(diǎn)測(cè)序圖

討 論

ABO血型系統(tǒng)是人類第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的也是最重要的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，對(duì)于保障安全輸血、組織器官移植和法醫(yī)學(xué)鑒定等有著十分重要的意義。ABO血型系統(tǒng)的基因位點(diǎn)在第9號(hào)染色體9q34.1-q34.2，基因組全長(zhǎng)為19.5 kb，包括7個(gè)外顯子，有3個(gè)主要等位基因（A101、B101和O01）。ABO基因的A基因和B基因編碼分別產(chǎn)生αl，3-N-乙酰氨基-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和αl，3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，由其分別轉(zhuǎn)移連接N-乙酰氨基半乳糖和半乳糖，從而形成A和B抗原[2-3]。同時(shí)，ABO血型鑒定時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)正反定型不一致，一般表現(xiàn)為抗原抗體的異常出現(xiàn)、減弱或消失，究其原因?yàn)镈NA序列中的某個(gè)堿基發(fā)生了缺失、替代、插入、拼接點(diǎn)突變、等位基因雜交[4-5]等，從而產(chǎn)生了ABO亞型。

本文中的先證者為無償獻(xiàn)血者，因正反定型不符送本實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)，家系調(diào)查顯示變異位點(diǎn)遺傳自其父親。根據(jù)血清學(xué)結(jié)果及遺傳學(xué)規(guī)律，結(jié)合基因測(cè)序結(jié)果推測(cè)，先證者及其父親ABO基因單鏈1在ABO*A1.01基礎(chǔ)上產(chǎn)生1A＞G，467C＞T，903C＞T變異，編碼出抗原減弱的A亞型。本研究中c.903C＞T屬于同義突變，即突變前后表達(dá)的氨基酸一致，不影響基因的表達(dá)。而c.1A＞G和c.467C＞T變異導(dǎo)致第1位甲硫氨酸被纈氨酸取代（p.Met1Val）以及第156位脯氨酸被異亮氨酸取代（p.Pro156Leu），編碼功能非常弱的A-糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)而影響表型檢測(cè)[6]。c.467C＞T是常見的A1多態(tài)性，即ABO*A1.02，A抗原在這些個(gè)體的紅細(xì)胞膜上表達(dá)正常[7]，因此推測(cè)本文中A抗原減弱與c.467C＞T變異無直接關(guān)系，而與c.1A＞G變異相關(guān)。根據(jù)ISBT（International Society of Blood Transfuion，國(guó)際輸血協(xié)會(huì)）網(wǎng)站“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”，ABO*Aw16可發(fā)生c.1A＞G變異。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)c.1A＞G變異也可見于ABO*Aw43[8]和ABO*A3.09[9]，該變異改變了第1外顯子上編碼αl，3-N-乙酰氨基-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的起始密碼子，導(dǎo)致翻譯開始的位點(diǎn)推后，因而生成的A轉(zhuǎn)移酶N端截短，同時(shí)A抗原表達(dá)明顯減弱。另外，肖建宇等人推測(cè)ABO*Aw43等位基因的c.721C＞T變異也可導(dǎo)致A抗原減弱[10]。本研究發(fā)現(xiàn)的c.1A＞G、c.467C＞T、c.903C＞T突變型組合暫未在ISBT的“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”數(shù)據(jù)庫中檢索到。

通常，ABO亞型可通過血清學(xué)方法進(jìn)行判斷及確認(rèn)，但部分亞型標(biāo)本仍需要結(jié)合基因測(cè)序才能準(zhǔn)確定型。因此在血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意觀察正反定型時(shí)細(xì)胞凝集的強(qiáng)度及其一致性，必要時(shí)結(jié)合基因測(cè)序加以確認(rèn)，以免誤判，從而保證臨床輸血治療的安全性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突