李小薇 趙明明 雷慧芬 李翠瑩

空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍特色醫(yī)學(xué)中心輸血科，北京 100142

Rh血型系統(tǒng)是人類血型系統(tǒng)中最復(fù)雜且最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)，其臨床意義僅次于ABO血型系統(tǒng)[1-3]。ISBT目前確認的Rh血型系統(tǒng)抗原達56個，其中D、C、c、E和e抗原均具有很強的免疫原性，是臨床上產(chǎn)生同種免疫性抗體最常見的5種抗原。迄今為止，ISBT已經(jīng)確認了超過160種RHCE等位基因，這些等位基因可導(dǎo)致抗原弱表達、部分表達等變異體產(chǎn)生[4]。Rh缺失型D--是非常罕見的，即紅細胞上D抗原表達正常，但C/c、E/e抗原表達均缺失，其分子遺傳基礎(chǔ)多種多樣，包括基因插入、缺失、重排等。血型基因檢測方法能夠克服血型血清學(xué)檢測局限，結(jié)果判斷更加客觀，逐漸成為準確判斷疑難血型必不可少的重要輔助手段[5-7]。本研究對Rh缺失型D--患者及其父親血型采用血清學(xué)及RHCE基因外顯子測序研究，首次分析發(fā)現(xiàn)由于第8外顯子缺失導(dǎo)致RhCE血型抗原不表達，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 研究對象

2023年3月就診于本中心兒科患者1名，男性，12歲，診斷為特應(yīng)性皮炎，既往無輸血史，送輸血科進行血型和不規(guī)則抗體篩查。

2 儀器與試劑

ABO血型反定細胞A1細胞、B細胞（批號：202302006，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司）；紅細胞不規(guī)則抗體篩查細胞（批號：202302001，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司）；IgM抗-C、抗-c、抗-E和抗-e單克隆抗體試劑（批號：2150031，BIOSCOT）；ABO及RHD血型鑒定凝膠卡（批號：202302006，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司），Rh分型鑒定凝膠卡（批號：202211007，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司）；核酸提取或純化試劑（批號：21072810T148，西安天隆科技有限公司）；核酸提取儀NP968-C（西安天隆科技有限公司），基因擴增儀LifeECO（杭州博日科技有限公司），通用型電泳儀JY300C（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），測序儀ABI 3130xl（美國ABI公司）。

3 方法

3.1 ABO及Rh血型血清學(xué)鑒定

采用微柱凝集法鑒定患者及其父親ABO及RhD血型，采用鹽水法和微柱凝集法鑒定患者Rh血型C、c、E和e表型，具體操作方法參照試劑說明書。

3.2 紅細胞不規(guī)則抗體篩查

采用微柱凝集法篩查患者紅細胞不規(guī)則抗體情況，具體操作方法參照試劑說明書。

3.3 DNA提取

按照試劑盒說明書提取患者及其父親血液標本DNA，采用微量紫外核酸分析儀測定DNA濃度和純度，調(diào)整DNA濃度至30 ng/μL，A260/A280為1.6～2.0。

3.4RH基因測序

患者及其父親樣本分別進行RHCE基因第1～10外顯子測序，確定基因型特征。采用Sanger測序法，將目的片段擴增后，測序儀進行RHCE基因第1～10外顯子測序，并讀取結(jié)果及分析。根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的RH（ISBT 004）Blood Group Alleles：RHCE（004RHCEalleles v4. 0_20180208），以及BLAST序列比對（標準序列BN000065.1以及RHCE*CeMN091966.1），確定是否存在基因突變及其所在基因位置，本研究設(shè)計測序引物與擴增引物一致（表1），測序反應(yīng)送公司完成（天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

表1 RHCE擴增（測序）引物序列

按照以下反應(yīng)體系對RHCE基因第1～10外顯子進行擴增：dNTP-Buffer工作液43.5 μL，Taq酶（5 units/μL）0.5 μL，特異性引物對（300 nM）1.0 μL，DNA 5 μL，總體積50 μL。

反應(yīng)程序如下：96℃ 2 min，1組循環(huán)；96℃20 s，68℃ 60 s，5組循環(huán)；96℃ 20 s，64℃ 50 s，72℃ 90 s，10組循環(huán)；96℃ 20 s，61℃ 50 sec，72℃ 90 s，25組循環(huán)；72℃ 5 min，1組循環(huán)。擴增產(chǎn)物使用2.5%瓊脂糖凝膠進行分離，確定產(chǎn)物條帶均一且亮度足夠后，進行測序。使用chromespro軟件以及DNAMAN8.0軟件進行比對分析。

結(jié) 果

1 ABO及Rh血型血清學(xué)鑒定

微柱凝集法顯示患者及其父親紅細胞ABO血型均為O型，微柱凝集法及鹽水法顯示患者紅細胞與抗-D凝集強度為4+，與抗-C、抗-c、抗-E 和抗-e凝集強度均為0，Rh血型為Rh缺失型D--；父親紅細胞與抗-D、抗-c、抗-E凝集強度為4+，與抗-C、抗-e凝集強度為0，Rh血型為RhccDEE（表2）。

表2 患者及其父親ABO及Rh血型血清學(xué)結(jié)果

紅細胞不規(guī)則抗體顯示患者血漿與紅細胞不規(guī)則抗體篩查3細胞凝集強度均為0，自身對照及直接抗人球蛋白試驗均為陰性。

2 RHCE基因測序擴增凝膠圖分析

RHCE*c和RHCE*C通常在第2外顯子上通過特異點進行區(qū)分（表3），但因為RHD和RHCE*C的第2外顯子上基因無區(qū)別點，故本例患者（RHD基因陽性）RHD基因第2外顯子干擾RHCE*C的檢出，本研究通過第12孔（RHCE*C在非外顯子區(qū)域內(nèi)含子2中表達剪切點位置區(qū)分于RHCE*c和RHD的特異性點[8]）檢測RHCE*C基因的存在?；颊呒捌涓赣H均檢測到RHCE*C（第12孔陽性）（圖1），證明均存在RHCE*C等位基因。擴增圖第2孔（CE-Exon2）檢測的是RHCE*c等位基因的第2外顯子，患者第2外顯子為陰性，故RHCE*c等位基因缺失；患者的父親第2外顯子為陽性，故RHCE*c等位基因存在。

圖1 患者及其父親RHCE基因第1～10外顯子測序擴增凝膠圖

表3 RHCE（ISBT 004）血型等位基因分布

3 RHCE基因測序分析

患者及其父親第2外顯子測序結(jié)果提示第2外顯子突變點是RHCE*C的突變點，進一步證明患者及其父親均存在RHCE*C等位基因（表3）?；颊叩?外顯子的突變均為純合，第1外顯子上存在48G＞C雜合突變，提示存在RHCE*c等位基因，在第5外顯子上未發(fā)現(xiàn)RHCE*E突變點（676G），并且第8外顯子為純合缺失，提示存在RHCE*Ccee等位基因但序列不完整，導(dǎo)致其抗原表達為RhD--，第3-7，9-10外顯子均未檢測到突變（圖2）?；颊叩母赣H第2外顯子的突變均為雜合，第1外顯子上存在48G＞C雜合突變，提示存在RHCE*c等位基因，在第5外顯子上發(fā)現(xiàn)RHCE*E突變點（676G＞C），提示其存在RHCE*CcEe等位基因；第3，4，6，7，8，9，10外顯子未檢測到突變，且根據(jù)患者第8外顯子為純合缺失，推測患者的父親為第8外顯子雜合缺失，缺失的單倍體為RHCE*Ce，導(dǎo)致其未能正確表達RhCe抗原，故患者的父親血清學(xué)表現(xiàn)為RhccDEE（圖3，表2）。因此，可以判斷患者RHCE基因型為RHCE*Ccee，但由于第8外顯子發(fā)生純合缺失，導(dǎo)致RhCe抗原不表達?；颊叩母赣HRHCE基因型為RHCE*CcEe，存在第8外顯子雜合缺失，且該變異的RHCE*Ce等位基因遺傳給了患者。

圖2 患者RHCE基因第1，2外顯子測序結(jié)果

圖3 患者的父親RHCE基因第1，2，5外顯子測序結(jié)果

討 論

Rh血型系統(tǒng)屬于復(fù)雜多變的血型系統(tǒng)，Rh抗原部分或者完全缺失是十分罕見的表型。日本研究人員在6萬多名獻血者中，研究發(fā)現(xiàn)Rh缺失型D--僅7例，頻率約為0.01%[9]。國內(nèi)針對Rh缺失型D--分布頻率的相關(guān)研究多為D--個案報道，尚未見Rh缺失型D--人群分布研究。目前血型的判斷仍然主要依據(jù)血清學(xué)結(jié)果，但在血型檢測過程中往往出現(xiàn)一些疑難樣本，結(jié)合血型基因檢測方法進行基因結(jié)構(gòu)分析和解讀，不僅可以準確鑒定患者血型，而且對于安全輸血具有重要的參考價值。

RH血型基因是由RHD與RHCE2個基因串聯(lián)排列組成的。RHD基因編碼D抗原，RHCE基因編碼C/c和E/e抗原，2個基因均由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，編碼417個氨基酸[10]。在Rh血型系統(tǒng)中，編碼RhC和Rhc抗原的RHCE等位基因有6個核苷酸不同，而編碼RhE和Rhe抗原的RHCE等位基因僅有1個核苷酸的差異，RHD和RHCE基因具有93.8%同源性，且緊密連鎖，因此2個基因之間易發(fā)生基因置換、基因雜交、基因重排等現(xiàn)象，引起RH基因變異[11-12]。Rh抗原缺失的血清學(xué)表現(xiàn)雖然為對應(yīng)的D、C、c、E、e抗原的缺失，但是其產(chǎn)生的分子機制卻不盡相同；即使是表型相同的Rh缺失型D--，其發(fā)生的分子機制也不一樣。張秀錚等[13]發(fā)現(xiàn)1例Rh缺失型D--的RHCE基因第1、10 外顯子檢出RHCE基因的特異性序列，而第2、3、6、7、8、9外顯子則全為RHD基因序列；伍偉健等[14]分析1例Rh缺失型D--，未檢出RHCE基因的特異性序列；左琴琴等[15]分析2例Rh缺失型D--，基因型分別為RHCE-D（3-7）-CE、RHCE-D（3-8）-CE，其發(fā)生與RHCE基因和RHD基因之間的基因重組相關(guān)；Flatt等[16]分析2例Rh缺失型D--，基因型分別為RHCE-D（2-8）-CE、RHCE-D（4-9）-CE；Pham等[10]研究發(fā)現(xiàn)RHCE基因剪接位點突變導(dǎo)致剪接模式的改變和缺失會引起mRNA轉(zhuǎn)錄本異常，影響RhC/c、E/e抗原表達。本文對Rh缺失型D--表型患者的分子遺傳背景研究發(fā)現(xiàn)，存在RHCE基因第8外顯子純合缺失導(dǎo)致RhCE血型抗原不表達。

Rh缺失型D--表型個體比較罕見，但因其RhC/c、E/e抗原均不表達，導(dǎo)致D--個體受到輸血或妊娠等免疫刺激后，很容易產(chǎn)生針對C/c、E/e位點的特異性抗體，即抗-Hro聯(lián)合抗體?？?Hro抗體為針對Rh血型系統(tǒng)的高頻抗原聯(lián)合抗體，采用吸收放散試驗很難將其分離并進行抗體特異性鑒定，其與普通Rh血型紅細胞均可發(fā)生凝集反應(yīng)，僅與Rhnull、Rhmod及RhD--紅細胞不發(fā)生凝集反應(yīng)[17-18]。因此，Rh缺失型D--個體受到免疫刺激產(chǎn)生抗-Hro抗體后，很難找到相合的血液與之匹配。此外，Rh缺失型D--育齡期女性一旦產(chǎn)生抗-Hro抗體，常常會導(dǎo)致習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎及胎兒新生兒溶血病等嚴重后果[19-21]。Rh缺失型D--個體血液極其稀有，臨床輸血時可選擇自體輸血或在家系成員中篩選配合型血液；孕婦存在胎兒新生兒溶血病時，可采用血漿置換，也可對新生兒進行提早分娩、靜脈注射免疫球蛋白、藍光照射等綜合治療方式，以取得滿意的療效。本文Rh缺失型D--表型患者為男性，既往無輸血史，紅細胞不規(guī)則抗體篩查陰性，已告知家屬患者為稀有血型，臨床輸血時選擇自體輸血或篩選親屬間配合型血液。

綜上所述，臨床患者的血型檢測聯(lián)合應(yīng)用血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，對于亞型、稀有血型、弱抗原或抗體等疑難血型的準確鑒定具有重要意義。本研究首次發(fā)現(xiàn)第8外顯子缺失造成RhCE血型抗原不表達，豐富了Rh抗原缺失變異造成血清學(xué)改變的情況，為解決患者安全輸血提供參考。本研究未能獲取患者母親的樣本，故患者另一條缺失第8外顯子的單倍體中其他外顯子的基因序列情況尚不清楚，后續(xù)研究希望通過單鏈測序等手段進行單倍體確認，以明確外顯子缺失和堿基突變對血型的影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。