荀志麗，馬小河，黃麗萍，王敏，趙旗峰*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 果樹研究所，山西 太原 030031；2.果樹種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；）

葡萄屬葡萄科（Vitaceae），葡萄屬（VitisL.），栽培葡萄起源時(shí)間大約在距今11 000 年前，是最早馴化的水果［1］。葡萄作為世界第二大水果，在世界果樹生產(chǎn)中占有重要位置。我國(guó)是全球最大的鮮食葡萄生產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%左右，自2011 年以來(lái)，我國(guó)鮮食葡萄產(chǎn)量已穩(wěn)居世界首位［2-3］。果實(shí)香氣化合物是葡萄品種適應(yīng)市場(chǎng)需求的一個(gè)重要品質(zhì)，是評(píng)價(jià)葡萄品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)［4］。葡萄果實(shí)中香氣化合物種類眾多，不同葡萄品種，因香氣物質(zhì)的組分、含量等不同而呈現(xiàn)出不同的香味［5-6］。因此，研究不同鮮食葡萄種質(zhì)果實(shí)香氣品質(zhì)具有重要意義。

對(duì)葡萄香味的研究表明，葡萄果實(shí)中香氣化合物的含量對(duì)葡萄酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，直接影響葡萄酒的感官特性。品種是影響葡萄果實(shí)香味特征的內(nèi)在及關(guān)鍵因素，不同釀酒葡萄、制汁葡萄及鮮食葡萄品種，其葡萄果實(shí)中的香氣成分均不同［7-9］。Zhang 等［10］深入分析了4 個(gè)釀酒葡萄的香氣成分，發(fā)現(xiàn)影響葡萄香氣的主要次生代謝物有萜類和酮類。ángela Díaz-Fernández［11］等對(duì)12 個(gè)釀酒葡萄品種香氣研究顯示，C6化合物和倍半萜類含量較高。譚偉等［12］對(duì)3 個(gè)釀酒葡萄及其不同營(yíng)養(yǎng)系香氣研究，發(fā)現(xiàn)不同品種香氣主要呈現(xiàn)物質(zhì)不同，梅鹿輒348和赤霞珠685 果實(shí)中主要香氣成分是β-大馬士酮和苯乙醛，梅鹿輒181 品麗珠c214 果實(shí)中主要香氣成分是己酸乙酯和丁酸乙酯。張文文等［13］對(duì)巨峰系葡萄夏黑、藤稔、巨峰果實(shí)的香氣物質(zhì)分析的結(jié)果顯示，夏黑的主要香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)是芳樟醇和C13類，藤稔的主要香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)是2-甲基丁酸乙酯，巨峰的主要香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)是丁酸乙酯。Xheng 等［14］研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄霞多麗在不同砧木之間果實(shí)香氣物質(zhì)也存在顯著差異。

葡萄果實(shí)中含有豐富的香氣化合物，并且品種之間有很大差異。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)釀酒葡萄香氣的研究較全面和深入，對(duì)鮮食葡萄特別是鮮食葡萄香味種質(zhì)群體研究較少。而釀酒葡萄和鮮食葡萄在不同區(qū)域同時(shí)起源，遺傳背景差異顯著，馴化路徑各異［1］。因此，為了系統(tǒng)鑒定鮮食葡萄種質(zhì)資源香氣物質(zhì)組分及含量分布情況，本文選用來(lái)自9 個(gè)不同國(guó)家的47 份具有不同香味的鮮食葡萄種質(zhì)，利用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)描述統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析、主成分分析、偏最小二乘-判別以及香味雷達(dá)圖分析等方法，對(duì)其成熟果實(shí)中的香氣物質(zhì)成分及含量進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，分析其果實(shí)香味的遺傳多樣性，旨在為香味葡萄種質(zhì)資源的開發(fā)利用及核心種質(zhì)構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自國(guó)家種質(zhì)資源太谷葡萄圃（37°23N，112°32E，海拔830 m，年均溫10.6 ℃，無(wú)霜期160～180 d，年降水量400～600 mm），取樣時(shí)間為2021 年6-10 月，具有香氣風(fēng)味的鮮食葡萄種質(zhì)資源47 份（表1），其中歐亞種30 份，歐美雜種17 份。分別于每份種質(zhì)果實(shí)成熟期，隨機(jī)采集3 株葡萄樹上長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害的健康果實(shí)，液氮速凍，-80 ℃保存。

表1 47 份鮮食葡萄種質(zhì)資源Table 1 47 germplasm resource of table grape

1.2 試驗(yàn)方法

采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定葡萄成熟果實(shí)香氣化合物［4］。操作方法：果實(shí)去果梗去核，加維生素C（50 mg·L-1）2 mL，榨汁機(jī)勻漿，4 ℃離心20 min，取6 mL 上清液并加1.5 g NaCl和5 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，155 mg·L-1）于20 mL 空瓶中。提取完成后進(jìn)行萃取，50 ℃條件下萃取40 min 后將萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）插入GC 口，熱解析5 min。氣相色譜為Thermo Trace 1300，質(zhì)譜為Thermo Trace ISQ，毛細(xì)管柱為VF-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣，流速為每分鐘1 mL·min-1。柱溫箱的升溫程序：40 ℃保持5 min，接著以每分鐘5 ℃的速度升溫至230 ℃，保持5 min；再以每分鐘20 ℃的速度升溫至250 ℃，保持5 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2007 和SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan 法進(jìn)行差異顯著性比較（P＜0.05）。利用質(zhì)譜全離子掃描的圖譜，依據(jù)NIST2011 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)的參考對(duì)葡萄香氣物質(zhì)進(jìn)行定性；以目標(biāo)化合物峰值和內(nèi)標(biāo)2-辛醇峰值的比值乘以內(nèi)標(biāo)2-辛醇含量進(jìn)行定量分析。利用邁維云平臺(tái)進(jìn)行主成分（PCA）分析，利用MetaboAnalyst進(jìn)行偏最小二乘-判別（PLS-DA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮食葡萄種質(zhì)果實(shí)中香氣物質(zhì)種類比較

47份種質(zhì)果實(shí)中共檢測(cè)到73種香氣物質(zhì)，不同種質(zhì)中香氣物質(zhì)種類表現(xiàn)不同。如圖1 所示按照化學(xué)官能團(tuán)將香氣物質(zhì)分為7 類，其中C6化合物、醇類、萜類和酯類種類較豐富。巨峰（JF）種質(zhì)中香氣種類最豐富，其次為藤稔（TR），含有63 種香氣物質(zhì)，乍娜（ZN）種質(zhì)中香氣種類最少，僅有36種。

圖1 47 份鮮食葡萄種質(zhì)資源香氣化合物種類Fig.1 Aroma components in the 47 table grapes resource

2.2 鮮食葡萄種質(zhì)成熟果實(shí)中香氣化合物含量分析

表2為47份葡萄種質(zhì)成熟果實(shí)中香氣化合物含量，不同種質(zhì)中所含香氣物質(zhì)含量不同。C6化合物在奧利文（ALW）種質(zhì)中含量最高為2 616.81 μg·L-1，在早霞玫瑰（ZXMG）種質(zhì)含量最低僅93.69 μg·L-1，在大粒玫瑰香（DLMGX）、白哈麗麗（BHLL）、維金拉斯（WJLS）種質(zhì)中含量均較高；酯類物質(zhì)在藤稔種質(zhì)中含量最高為344.55 μg·L-1，在乍娜、黑美人（HMR）、東方之星（DGZX）、早康寶（ZKB）、羅吉玫瑰（LJMG）種質(zhì)中未檢測(cè)出；萜烯類物質(zhì)在奧利文種質(zhì)中含量最高為3 658.63 μg·L-1，在白哈麗麗、美國(guó)綠（MGL）、巨峰（JF）種質(zhì)中含量極低。

表2 47 份葡萄種質(zhì)香氣物質(zhì)含量Table 2 The contents of aroma components in the 47 table grapes 單位：μg·L-1

2.3 鮮食葡萄種質(zhì)香氣化合物含量的描述性統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)47 份鮮食葡萄種質(zhì)果實(shí)成熟期的香氣物質(zhì)含量進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析（表3），結(jié)果顯示，47 份種質(zhì)果實(shí)中總香氣物質(zhì)含量范圍為385.57～6 618.33 μg·L-1，平均值為1 340.69 μg·L-1，變異系數(shù)為23.51%，含量大于平均值的種質(zhì)有17份，按照含量高低依次為奧利文、阿登納玫瑰（ADNMG）、茉 莉 香（MLX）、沙 巴 珍 珠（SBZZ）、無(wú) 核 翠 寶（WHCB）、秀特玫瑰（TXMG）、愛神玫瑰（ASMG）、瑞都科美（RDKM）、甜菜（TC）、大粒玫瑰香、羅吉玫瑰、藤稔、玫瑰香（MGX）、著色香（ZSX）、白哈麗麗、維金拉斯、秋紅寶（QHB）。香氣物質(zhì)中萜烯類變異系數(shù)最大為37.53%，其次為C6化合物及酯類，變異系數(shù)大說(shuō)明遺傳多樣性豐富。

表3 47 份葡萄種質(zhì)香氣化合物含量的描述統(tǒng)計(jì)分析Table 3 The descriptive statistical analysis of aroma compound contents in 47 table grape germplasm

2.4 主成分分析

香氣值（OAV）是評(píng)價(jià)葡萄中香氣化合物對(duì)香氣貢獻(xiàn)的一個(gè)常規(guī)指標(biāo)，通常由香氣化合物的濃度除以其感官閾值得到。為了進(jìn)一步分析不同葡萄種質(zhì)之間的差異，以O(shè)AV 值大于1 的18 種香氣化合物（表4）為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行主成分分析（PCA）。結(jié)果表明（圖2），藤稔、美國(guó)綠、白哈麗麗、無(wú)核翠寶、奧利文、茉莉香（MLX）、阿登納玫瑰、京早晶（JZJ）、大粒玫瑰香可以很好區(qū)分開來(lái)，說(shuō)明這9 份種質(zhì)在香氣存在特殊性。

圖2 47 份鮮食葡萄香氣化合物主成分分析Fig.2 Principal component analysis

表4 主要香氣物質(zhì)香氣描述Table 4 Descriptor of main aroma compounds

2.5 偏最小二乘-判別（PLS-DA）分析

為了進(jìn)一步鑒定上述9 種葡萄種質(zhì)果實(shí)香氣化合物之間的差異，對(duì)其進(jìn)行偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）。如圖3 所示，根據(jù)變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）可得到上述9 個(gè)鮮食葡萄特征性香氣化合物。其中己醛和香葉醇VIP 值最高，阿登納玫瑰的果實(shí)香氣與芳樟醇關(guān)聯(lián)性較高；奧利文的果實(shí)香氣與己醛、香葉醇、3-己烯醛、α-松油醇、壬醛、β-羅勒烯關(guān)聯(lián)性較高；白哈麗麗與己醛關(guān)聯(lián)性較高；大粒玫瑰香與3-己烯醛關(guān)聯(lián)性較高；京早晶的果實(shí)香氣與2-壬烯醛和β-紫羅蘭酮聯(lián)性較高；美國(guó)綠與己酸乙酯和β-紫羅蘭酮關(guān)聯(lián)性較高；茉莉香的果實(shí)香氣與橙花醇和氧化玫瑰關(guān)聯(lián)性較高；藤稔的果實(shí)香氣與己酸乙酯關(guān)聯(lián)性較高；無(wú)核翠寶的果實(shí)與右旋萜二烯和β-大馬士酮關(guān)聯(lián)性較高。

圖3 不同葡萄種質(zhì)香氣化合物偏最小二乘-判別分析Fig.3 PLS-DA analysis of aroma compounds from different table grape germplasm

2.6 香味雷達(dá)圖分析

為進(jìn)一步探究不同葡萄種質(zhì)特征香味，根據(jù)主成分分析及聚類分析結(jié)果，按照表4 中主要香氣物質(zhì)的香氣特征累加，得到阿登納玫瑰、奧利文、白哈麗麗、大粒玫瑰香、茉莉香、京早晶、茉莉香、藤稔、無(wú)核翠寶9 個(gè)葡萄果實(shí)的香氣雷達(dá)圖（圖4）。可以看出，9 個(gè)不同葡萄品種香味特征顯著不同。藤稔主要表現(xiàn)為果香；無(wú)核翠寶主要表現(xiàn)為果香和甜香；奧利文葡萄果實(shí)中青草、果香、薄荷味和脂膏香均較突出；京早晶葡萄蜂蜜味濃厚；阿登納玫瑰主要表現(xiàn)為花香、果香和脂膏香。

圖4 香氣雷達(dá)圖Fig.4 Aroma radar chart analysis of aroma compounds

3 討論

葡萄果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)含量是影響果實(shí)品質(zhì)的關(guān)鍵因素，品種資源多樣性是育種工作的核心，鑒定葡萄種質(zhì)成熟果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的組成及含量，對(duì)葡萄資源的開發(fā)利用及育種具有重要意義。遺傳多樣性與種質(zhì)群體的變異系數(shù)大小相關(guān)［15］，本文47 份種質(zhì)資源中，其香氣化合物組成及含量范圍較大，變異系數(shù)較高，說(shuō)明該47 份鮮食葡萄種質(zhì)遺傳豐度較高。

葡萄果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)種類較多，其中C6化合物、酯類和萜烯類物質(zhì)含量較高［16］。香氣化合物包括C6化合物、萜烯、酮類等對(duì)葡萄特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，含量各不相同［17］。本文對(duì)47 份鮮食葡萄種質(zhì)資源果實(shí)中的香氣化合物測(cè)定，同樣發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)資源香氣化合物組分及含量存在差異。有些種質(zhì)C6化合物種類豐富，比如奧利文；有些種質(zhì)萜烯類物質(zhì)豐富，比如奧利文、無(wú)核翠寶、阿登納玫瑰等；其中OAV 大于1 的18 種化合物中，主要包括C6化合物、酯、萜烯和酮類，與前人研究結(jié)果一致。C6化合物是一類來(lái)自脂肪酸代謝途徑的含有6 個(gè)C 原子的醇和醛，幾乎存在于所有葡萄種質(zhì)中，本文47 份鮮食葡萄種質(zhì)成熟期果實(shí)中均含有C6化合物4～11種，大粒玫瑰香種質(zhì)中含量較高，其中OAV 大于1 的C6化合物有己烯醛和己醛。孫磊等［18］對(duì)不同砧木鮮食葡萄香氣研究發(fā)現(xiàn)，瑞都紅玉砧木組合中主要以1-己醇、2-己烯醇、2-己烯醛、己醛、己烯醛為主，其中己烯醛含量較高，主成分分析同樣位于第一主成分的正半軸。說(shuō)明，C6化合物中的己醛和己烯醛對(duì)鮮食葡萄果實(shí)香味的貢獻(xiàn)率較高。

對(duì)9 個(gè)釀酒葡萄進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)香氣物質(zhì)種類最多的是酯類，其次是醛類、酮類和萜烯類［19］。酯類物質(zhì)主要貢獻(xiàn)果香味，不同種類果實(shí)的酯類物質(zhì)組分及含量存在差異。揮發(fā)性酯類物質(zhì)主要來(lái)源于脂肪酸途徑和氨基酸途徑，蘋果果實(shí)中主要為乙酸己酯和丁酸己酯［20］，桃果實(shí)中以乙酸己酯為主［21］，而香蕉果實(shí)中主要為乙酸丁酯和丁酸乙酯［22］。本文47 份鮮食葡萄種質(zhì)的酯類種類有0～23 種，藤稔和寒香蜜種質(zhì)中含量較高，按照OAV 大于1 的標(biāo)準(zhǔn)，酯類物質(zhì)中對(duì)香味貢獻(xiàn)大的主要為乙酸甲酯、戊酸乙酯和己酸乙酯。Wu 等［23］對(duì)16 個(gè)主栽鮮食葡萄品種香氣組分研究發(fā)現(xiàn)，酯類物質(zhì)以乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯為主，其中乙酸乙酯和乙酸丁酯分布較廣，除了陽(yáng)光玫瑰種質(zhì)外，其余15 個(gè)品種均含有乙酸乙酯，除巨玫瑰種質(zhì)外，其余15 個(gè)品種均含有乙酸丁酯。陳迎春［24］對(duì)6 個(gè)早熟鮮食葡萄的香氣成分分析得出，紅香蕉和黑香蕉種質(zhì)中酯類物質(zhì)己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯對(duì)香味貢獻(xiàn)率較大。說(shuō)明，釀酒葡萄與鮮食葡萄香氣主要貢獻(xiàn)酯類物質(zhì)不同，不同鮮食葡萄種質(zhì)中酯類物質(zhì)主要貢獻(xiàn)香氣也同樣存在差異。

‘Campbell Early’和‘Muscat of Alexandria’雜交群體的揮發(fā)性物質(zhì)QTL 分析發(fā)現(xiàn)，萜烯類、酮類香氣物質(zhì)具有顯著效應(yīng)的QTL 位點(diǎn)［25］。萜烯類物質(zhì)因其香味濃郁，且閾值低，被認(rèn)為是玫瑰香型葡萄的典型香氣成分［26-27］。另有研究認(rèn)為香茅醇、芳樟醇、香葉醇、α-松油醇和橙花醇是葡萄呈現(xiàn)玫瑰香味的主要香氣成分［28］。有研究認(rèn)為芳樟醇、香葉醇、橙花醇是葡萄呈現(xiàn)玫瑰香味的特征香氣成分［29］。孫磊等［30］對(duì)香妃和早玫瑰香單萜積累的研究表明，對(duì)香味貢獻(xiàn)較大的單萜物質(zhì)有芳樟醇、β-月桂烯、羅勒烯、氧化玫瑰。Yue［31］等對(duì)玫瑰香葡萄單萜物質(zhì)積累的研究表明玫瑰香葡萄成熟果實(shí)中含量較高的單萜烯有芳樟醇、香葉醇和α-萜品烯。譚偉等［32］對(duì)早黑寶、秋黑寶、晚黑寶、四倍體玫瑰香果實(shí)香氣物質(zhì)的研究表明，C6醛是各葡萄品種果實(shí)芳香物質(zhì)中最主要的成分，芳樟醇和香葉醇是玫瑰香味葡萄的主要香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)。本文47 份鮮食葡萄果實(shí)中萜烯類化合物包括25 種，奧利文、無(wú)核翠寶、阿登納玫瑰種質(zhì)中萜烯類成分種類較多，羅勒烯、β-月桂烯、α-松油醇、橙花醇、芳樟醇、右旋萜二烯、α-萜品烯、氧化玫瑰8 種萜烯化合物是香氣主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，與前人研究一致。萜烯化合物和C13-降異戊二烯化合物可以賦予釀酒葡萄及葡萄酒特殊的香味［33-34］，本文中β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮同樣是香氣主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了另一種主要香氣物質(zhì)2-辛酮。

4 結(jié)論

本文從47 份鮮食葡萄種質(zhì)中篩選出9 份具有特征香氣物質(zhì)種質(zhì)，分別為藤稔、美國(guó)綠、白哈麗麗、無(wú)核翠寶、奧利文、茉莉香、阿登納玫瑰、京早晶、大粒玫瑰香，呈現(xiàn)不同香味。并進(jìn)一步確定了其呈現(xiàn)香味的主要特征香氣物質(zhì)，分別為己酸乙酯、己酸乙酯和β-紫羅蘭酮、己醛、右旋萜二烯和β-大馬士酮、香葉醇和α-松油醇、橙花醇和氧化玫瑰、芳樟醇、2-壬烯醛和2-辛酮、3-己烯醛。