劉 斌,劉 娜,曹廣林

隨著生活方式的改變和生活節(jié)奏的加快,心血管疾病的發(fā)生率逐漸趨于年輕化。心肌缺血再灌注損傷造成的心肌細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙是心肌缺血再灌注病人發(fā)生心力衰竭的主要原因[1]。研究表明,降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平可明顯減少心肌細(xì)胞凋亡,改善線粒體功能障礙[2]。miRNA是一種單鏈非編碼RNA,研究發(fā)現(xiàn),多種miRNA參與調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷[3-5],miRNA-93-5p對(duì)膿毒癥造成的心肌損傷以及糖尿病腎病等具有保護(hù)作用[6-7]。本研究旨在探討miR-93-5p在缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑及儀器

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司;miR-93-5p陰性對(duì)照片段以及miR-93-5p mimic購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;miR-93-5p和U6的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列購(gòu)自中國(guó)廣州銳博公司;兔抗大鼠活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specificproteinase-3,Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京華美試劑公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)自沈陽(yáng)市醫(yī)療器械二廠;培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)NAPCO公司。

1.3 分組及給藥

將H9c2心肌細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),置于37 ℃ 5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí),進(jìn)行傳代。取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組(control組)、H/R組、miR-93-5p陰性對(duì)照組(miR-NC組)、miR-93-5p模擬物組(miR-93-5p mimic組)。miR-NC組轉(zhuǎn)染miR-93-5p陰性對(duì)照片段50 μmol/L,miR-93-5p mimic組轉(zhuǎn)染miR-93-5p模擬物50 μmol/L。24 h后,除control組外,其余3組建立H/R模型。首先,將不含血清和糖的DMEM培養(yǎng)基用混合氣體(95%N2和5%CO2)平衡2 h制備飽和缺氧液,將心肌細(xì)胞中原有的培養(yǎng)液棄掉,加入飽和過(guò)的缺氧液,并放置在37 ℃含有95%N2和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h,建立缺氧模型。10 h后,棄掉缺氧液,加入含糖和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃含有95%O2和5%CO2的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)2 h,建立復(fù)氧模型。control組心肌細(xì)胞置于含糖和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37 ℃含有95%O2和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定miR-93-5p的表達(dá)水平

復(fù)氧結(jié)束后,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2次,Trizol試劑完全裂解細(xì)胞,細(xì)胞裂解液用氯仿抽提,異丙醇沉淀后,收集總RNA。紫外分光光度計(jì)鑒定RNA濃度和純度。取1 μL樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min;95℃ 30 s;58 ℃ 40 s;共40個(gè)循環(huán)。所有樣品均進(jìn)行5次重復(fù)操作。以U6作為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算miR-93-5p的相對(duì)表達(dá)水平。miR-93-5p的引物序列見表1。

表1 基因及引物序列

1.5 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率

各組心肌細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后,MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率。將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,每孔3 000個(gè)細(xì)胞,每孔中再加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去上層清液后,每孔再加入200 μL的二甲基亞砜,振蕩孵育10 min后,放置在酶標(biāo)儀上,設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm,測(cè)定A值,參照試劑盒說(shuō)明書指定標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算心肌細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

各組心肌細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后,胰酶消化細(xì)胞,PBS洗滌重懸,加入500 μL緩沖液混勻,取100 μL細(xì)胞懸液加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)孵育10 min,然后加入碘化丙啶(PI)孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀和Flowjo軟件分析心肌細(xì)胞凋亡率。

1.7 氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)檢測(cè)

各組心肌細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后,棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基,收集細(xì)胞,冰浴中用超聲細(xì)胞粉碎儀處理30 s,之后,4 ℃下3 500 r/min離心10 min,收集上清。根據(jù)各試劑盒說(shuō)明書,用紫外-可見分光光度計(jì)平行測(cè)定各組細(xì)胞裂解液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性,硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量,二硫雙硝基苯甲酸定量法檢測(cè)GSH-Px活性。

1.8 ELISA檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)

各組心肌細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后,收集上清液檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)。首先,用包被液稀釋包被抗原,最適濃度為5～20 μg/mL,450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值,根據(jù)說(shuō)明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。反應(yīng)板每孔各加入0.3 mL,37 ℃水浴2 h,棄掉包被液,加入洗滌緩沖液洗滌。每孔加入經(jīng)稀釋過(guò)的待測(cè)上清液0.2 mL,37 ℃水浴2 h。洗滌后,每孔加入稀釋過(guò)的酶結(jié)合物0.2 μL,37 ℃水浴2 h。洗滌后,加入鄰苯二胺溶液0.2 μL,室溫靜置30 min,每孔加入0.05 μL終止液。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)調(diào)至490 nm處,測(cè)量A值。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)心肌細(xì)胞中蛋白表達(dá)

各組心肌細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后,棄去上清液,預(yù)冷過(guò)的PBS洗滌各組細(xì)胞,各洗3次,加入50 μL的RIPA裂解液,置于冰上30 min,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。按照實(shí)驗(yàn)分組依次加入各蛋白樣品20 μL,120 V恒壓電泳,直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部,結(jié)束電泳。采用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h,室溫封閉1 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)法顯色,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞中miR-93-5p表達(dá)比較

各組miR-93-5p表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組miR-93-5p表達(dá)降低(P<0.05);與H/R組比較,miR-93-5p mimic組miR-93-5p表達(dá)升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組miR-93-5p表達(dá)升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞中miR-93-5p表達(dá)比較

2.2 各組心肌細(xì)胞存活率比較

各組心肌細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞存活率降低(P<0.05);與H/R組比較,miR-93-5p mimic組心肌細(xì)胞存活率升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組心肌細(xì)胞存活率升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組心肌細(xì)胞存活率比較 單位:%

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

各組心肌細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與H/R組比較,miR-93-5p mimic組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。詳圖1、表4。

表4 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 單位:%

2.4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、GSH-Px水平比較

各組SOD、GSH-Px、MDA水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組SOD、GSH-Px水平降低,MDA水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H/R組、miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組SOD、GSH-Px水平升高,MDA水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)比較

2.5 各組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與H/R組、miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 單位:ng/L

2.6 各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與control組比較,H/R組Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H/R組、miR-NC組比較,miR-93-5p mimic組Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低,Bcl-2蛋白表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表7、圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)條帶圖

表7 各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞由長(zhǎng)時(shí)間的缺血缺氧狀態(tài)到吸入大量的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致線粒體功能損傷,活性氧過(guò)度產(chǎn)生,氧化應(yīng)激水平升高,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞損傷觸發(fā)炎癥反應(yīng),大量炎性因子釋放,進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞凋亡。過(guò)度的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平引起細(xì)胞凋亡、纖維化和細(xì)胞自噬[8-11],抑制炎癥和氧化應(yīng)激水平可減少心肌缺血再灌注或H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[12]。既往研究表明,miR-93-5p通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)/髓分化因子88(MyD88)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路抑制脂多糖造成的炎癥反應(yīng),改善急性肺損傷[13]。本研究通過(guò)建立H/R心肌細(xì)胞模型,探討miR-93-5p對(duì)H/R造成的心肌細(xì)胞損傷的影響。

SOD和GSH-Px是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一類抗氧化酶,線粒體損傷時(shí),過(guò)度產(chǎn)生活性氧,使氧化應(yīng)激水平升高,而GSH-Px可有效清除活性氧,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整。SOD具有清除超氧陰離子的作用,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,其活性的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[14],而MDA水平則間接反映氧自由基對(duì)細(xì)胞損傷的程度。心肌細(xì)胞損傷觸發(fā)TNF-α的釋放,進(jìn)一步刺激炎性因子的分泌,如IL-1β、IL-6、黏附分子等,而促炎因子的大量分泌,會(huì)進(jìn)一步加重心肌損傷。在本研究中,心肌缺血再灌注時(shí),SOD和GSH-Px活性降低,MDA水平升高,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,由于活性氧和氧自由基清除受到阻礙,以及促炎因子大量釋放,導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高。miR-93-5p參與調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程,如高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移、纖維化及心肌細(xì)胞凋亡等[15-16]。為了探討miR-93-5p對(duì)H/R造成的心肌細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用,采用miR-93-5p mimic孵育心肌細(xì)胞后,建立H/R模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-93-5p過(guò)表達(dá)增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性,降低MDA以及炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平,心肌細(xì)胞存活率升高,凋亡率降低,表明,miR-93-5p通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng),改善H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

細(xì)胞凋亡受到促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的共同調(diào)控,兩類凋亡蛋白失衡,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶,在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,其中Caspase-3位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵位置,是重要的凋亡蛋白酶。Bcl-2家族同樣是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要家族,Bcl-2通過(guò)干擾細(xì)胞色素C的釋放,阻斷Caspase蛋白酶的激活,抑制細(xì)胞凋亡。Bax作為Bcl-2家族重要的促凋亡蛋白,其表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bax是線粒體膜上離子通道的組成部分,可以使細(xì)胞色素C穿過(guò)線粒體膜,激活Caspase-3,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)情況,H/R使心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)增加,Bcl-2蛋白表達(dá)降低,miR-93-5p過(guò)表達(dá)使Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低,Bcl-2蛋白表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-93-5p通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述,miR-93-5p可有效抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,可能是通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)和降低氧化應(yīng)激水平發(fā)揮作用,為臨床治療心肌缺血再灌注提供理論支持。