呂霖漪,劉學兵

心血管疾病是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率較高的疾病之一,其中藥物治療效果差及難治性心臟病病人逐年增加。隨著超聲分子影像及精準醫(yī)療的發(fā)展,超聲靶向微泡破壞技術(UTMD)聯(lián)合基因治療具有簡便、微創(chuàng)性、靶向性、安全性等優(yōu)點,已成為近年來研究的熱點之一。相關研究表明,UTMD搭載基因治療心血管疾病,在基因或分子靶向精準傳遞方面具有安全、可重復的特點[1],可提高基因轉(zhuǎn)染率[2-3]、促進血管再生[4]、改善心室重構[5]、恢復心功能,在心臟疾病治療中顯示出良好的發(fā)展前景。現(xiàn)對UTMD應用于心臟疾病治療的研究進展進行綜述。

1 UTMD的作用原理

因微泡中氣體強反射超聲的物理特性,常作為超聲造影劑,在可視情況下超聲輻照微泡可實現(xiàn)被動靶向爆破;另外一種在微泡上連接靶向物質(zhì),使微泡向靶組織聚集,實現(xiàn)主動靶向,高能超聲輻照使微泡“爆破”,在組織局部產(chǎn)生“空化效應”“機械效應”及“溫熱效應”等多種生物學效應。其中“空化效應”中的“瞬態(tài)空化”或稱“慣性空化”,使微泡內(nèi)部產(chǎn)生能量的局部聚集融合,內(nèi)部溫度與壓力不斷增大,微泡自身發(fā)生振動,不斷膨脹與縮小,達到臨界直至爆裂釋放出能量[6]。該過程可產(chǎn)生一定程度的高振幅震蕩、沖擊波、內(nèi)切力等,對血管環(huán)境造成一定影響,改變血管內(nèi)皮細胞狀態(tài),使內(nèi)皮細胞膜產(chǎn)生短暫的孔隙,增強細胞膜、血管通透性,破壞血管內(nèi)血栓等。若微泡內(nèi)結合其他物質(zhì),如基因、藥物等,在空化效應的作用下實現(xiàn)可視化靶向治療。因微泡可吸收和散射比周圍組織更大的超聲信號,故可改變超聲信號壓力,有效提高成像對比度,增強圖像質(zhì)量[7]。超聲波輻照微泡可降低超聲空化閾值,產(chǎn)生的機械刺激、熱效應及生物效應,誘導心肌細胞膜通透性改變、鈣離子濃度改變及血流量增加,最終促進心肌細胞正性肌力作用[8]。根據(jù)超聲靶向爆破微泡這一原理,該技術在臨床工作中應用,尤其是在心血管疾病的治療中取得了顯著的進展。

2 心臟疾病靶向微泡的研究進展

靶向微泡材料多樣,多由氣核和外殼組成。常用的包括蛋白質(zhì)類、脂類物質(zhì)、糖類物質(zhì)、高分子聚合物等,不同材質(zhì)的微泡在應用中發(fā)揮著不同的作用。目前臨床應用中的微泡多數(shù)含有氟化氣體。有研究表明,人血清清蛋白中加入蔗糖并通入低溶解性的惰性氣體如全氟丙烷氣體,可獲得穩(wěn)定的清蛋白微泡[8],當其組成達到一定比例、濃度達到一定數(shù)值時,有較好的心肌顯影,常作為分子成像造影劑。因清蛋白帶有正電荷的氨基和帶負電荷的羧基,當心肌發(fā)生炎癥時,該區(qū)域的酸堿度及電荷發(fā)生變化,清蛋白微泡的電荷與該區(qū)域的電荷相吸,發(fā)生微泡延遲清除,從而達到靶向顯影。與通入可溶性氣體比較,通入低溶解性惰性氣體的微泡在血液中具有較好的穩(wěn)定性,可獲得較長的存留時間[9]。與蛋白質(zhì)類微泡比較,脂類微泡具有較好的穩(wěn)定性、選擇性、靶向性,因其能在水中形成脂質(zhì)體,可在某特定部位大量快速聚集,顯著增強回聲信號,達到更佳造影效果,常用于基因荷載、無創(chuàng)評價心肌功能、定位病灶部位并評估嚴重程度等。Phillips等[10]研究顯示,靶向血管細胞黏附分子1(VCAM-1)微泡可增強圖像強度,有助于早期發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化。相關研究顯示,采用磷脂雜化法技術制備的微泡具有的穩(wěn)定性和顯影效果[11]。陽離子脂質(zhì)制備的微泡具有較好的基因攜帶能力[12]。Zhang等[13]研究顯示,由于陽離子微泡(CMBs)具有較高的陽性電位,其DNA結合能力顯著增強,每5×108CMB的DNA裝載量為(17.81±1.46)μg。糖類物質(zhì)組成的微泡具有較好的安全性及生物相容性。高分子聚合物組成的微泡具有穩(wěn)定性的膜成分,可有效抵御巨噬細胞的吞噬,用于免疫系統(tǒng)造影,如淋巴循環(huán)。通過制備淋巴細胞-微泡復合物,探討移植心臟早期的急性淋巴細胞排斥反應[14]。因重組人尿激酶原可特異性靶向溶栓,有研究將尿激酶與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(RGDS)按一定比例結合,并與微泡聯(lián)合組成的復合物用于血栓的溶解再通,結果顯示再通率高達93%[15]。

3 用于經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術后并發(fā)癥的治療

PCI手術常用于治療冠狀動脈狹窄,通過經(jīng)皮置入支架或球囊擴張建立血管再通。急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)病人PCI術前、術后,向微血管內(nèi)注入微泡,并在超聲換能器的高或低機械指數(shù)脈沖下,評估進門至擴張時間,與急診采取PCI手術比較,可顯著提高左室射血分數(shù),且1個月后微血管阻塞比例明顯減小,有助于改善早期心外膜通暢率,提高微血管流量[16]。無復流、再狹窄是PCI術后常見并發(fā)癥,導致遠端心肌細胞無法維持血流灌注,嚴重影響病人預后。近年來PCI術后并發(fā)癥防治的研究逐漸增多。Phillips等[10]研究表明,VCAM-1靶向微泡能特異性與術后急性損傷的炎癥血管平滑肌細胞結合,進行基因與藥物傳遞,為早期檢測和治療支架內(nèi)再狹窄提供思路。王宇豪等[17]在大鼠頸動脈球囊損傷模型中攜Pik3cb shRNA的納米微泡聯(lián)合UTMD轉(zhuǎn)染,14 d后,內(nèi)膜與中膜面積(I/M)比值為(0.48±0.08),低于建模對照組的(0.96±0.12)和Pik3cb shRNA組的(0.66±0.07),結果表明攜Pik3cb shRNA微泡可顯著下調(diào)磷酸化蛋白激酶B(AKT)表達,進而抑制新生內(nèi)膜增生。

4 作為基因載體改善心功能

臨床基因載體常應用病毒。病毒載體因具有高轉(zhuǎn)染性,能在體內(nèi)高效、長期、穩(wěn)定表達,臨床科研中常用于基因轉(zhuǎn)染,同時具有易被免疫系統(tǒng)識別并清理、易被體內(nèi)溶酶體降解、難與細胞表面結合、難以穿透細胞或組織等缺點,臨床應用存在局限。近年來,人工制備的微泡一定程度克服了病毒載體應用的困難,微泡可參與介導基因轉(zhuǎn)染,提高基因表達,用于心力衰竭的治療,改善心功能,具有高靶向性、特異性結合靶細胞,毒副作用低,避開免疫系統(tǒng),高效率運載基因等優(yōu)點,可用于血管注射,在基因治療、基因轉(zhuǎn)染等分子生物學中應用廣泛。目前,UTMD逐漸應用于心力衰竭的基因治療,如用于傳遞腺病毒或質(zhì)粒DNA到心肌[18]。Erikson等[19]將UTMD用于傳遞反義寡核苷酸(AS-ODN)至缺血心肌內(nèi),對抗TRAF3IP2(缺血/再灌注能誘導TRAF3IP2在心臟的表達,產(chǎn)生不良后果),結果顯示,TRAF3IP2 AS-ODN能有效抑制心室不良重構。炎性小體(NLRP3)是糖尿病心肌病(DCM)的發(fā)病因素之一。肖雯婧等[20]研究SD大鼠發(fā)現(xiàn),在DCM中,通過制備負載siNLRP3(NLRP3小干擾RNA)的納米微泡并結合UTMD沉默NLRP3,具有增強對心肌的保護作用。Cao等[21]在心肌梗死24 h后犬體內(nèi)輸注含血管生成素1(Ang1)質(zhì)粒的微泡,并使用直徑為1 cm的換能器在心臟區(qū)域進行超聲基因轉(zhuǎn)染,采用300 kHz和2 W/cm2的連續(xù)波照射,每次間隔10 s,共20 min;與對照組比較,UTMD-Ang1組心功能改善,且心肌梗死后1個月時血漿去甲腎上腺素和N端B型利鈉肽(NT-BNP)水平顯著降低。

5 減少心肌細胞損傷及凋亡

Cui等[22]將UTMD與核定位信號多肽(NLS)結合組成新型基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng),將Ang1基因轉(zhuǎn)染到犬心肌梗死模型中,結果顯示,Ang1 mRNA和蛋白質(zhì)僅在UTMD結合NLS實驗組與單獨使用UTMD實驗組中表達,且UTMD結合NLS實驗組較單獨使用UTMD實驗組高出1.6倍,NLS參與協(xié)助DNA進入細胞核內(nèi),為UTMD用于基因轉(zhuǎn)染的研究提供了思路。隨著年齡的增長和心肌損傷的發(fā)生,生長分化因子11(GDF11)表達降低。Du等[23]通過UTMD介導的GDF11轉(zhuǎn)染有效保護老齡小鼠心臟免受缺血-再灌注損傷,改善了衰老心臟的活力。Zhang等[24]通過UTMD結合搭載非有絲原酸性成纖維細胞生長因子(NM-aFGF)納米微泡至DCM大鼠體內(nèi),觀察到該過程激活了AKT/糖原合酶激酶(GSK)/核因子E2相關因子2(Nrf-2)信號通路,抑制由糖尿病引起的心肌氧化應激損傷,最終逆轉(zhuǎn)DCM大鼠心肌結構和功能。微小核糖核酸(miRNA)在病理性心肌肥厚中表達失常。通過搭載抗miR-23a的微泡聯(lián)合UTMD對左心室肥厚大鼠進行治療,發(fā)現(xiàn)其可抑制心肌細胞肥大,保留心臟功能,首次發(fā)現(xiàn)通過UTMD給藥較全身給藥所需劑量低200倍以上[25]。Sun等[26]研究顯示,UTMD搭載miR-21進入阿霉素誘導的心臟毒性小鼠體內(nèi)可恢復心功能,減少細胞凋亡,為預防與治療化療后的心臟毒性提供思路。Zhong等[27]將UTMD搭載miR-150-5p用于治療心肌細胞損傷,通過抑制四肽重復結構域5(TTC5)表達,減輕糖氧剝奪(OGD)誘導的原發(fā)心肌細胞損傷,同時調(diào)節(jié)細胞因子水平抵消OGD治療對炎癥反應的影響。

6 有助于心肌血管再生并抑制心肌纖維化

急性心肌梗死是由于冠狀動脈急性收縮導致供血區(qū)域的心肌缺血缺氧,心功能急劇下降,嚴重可致壞死。向梗死區(qū)域內(nèi)輸注與血管再生相關細胞、因子、特定藥物等可協(xié)助血管再生以恢復局部血供,精確運送骨髓干細胞。Xu等[28]研究表明,超聲微泡聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞輸注可誘導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分泌,提高梗死心肌的血管再生率,改善區(qū)域血流灌注,相較于對照組,心肌纖維化面積減小了46.8%,提示具有抑制心肌纖維化和重構的作用。Chen等[29]研究顯示,再灌注成功后的急性心肌梗死病人,若于2～4周后僅給予骨髓細胞,無法改善心功能,若聯(lián)合超聲微泡,可有效促進心肌c-kit+細胞增殖,增強延遲的骨髓細胞向缺血心肌的特異性聚集,改善心功能,減輕心室重構。因脯氨酰羥化酶結構域蛋白2(PHD2)可降解在缺血心肌中具有保護作用的缺氧誘導因子1α(HIF-1α)。Zhang等[13]使用UTMD介導傳遞shRNA至缺血區(qū)域以沉默PHD2基因,結果顯示,實驗組增強型綠色熒光蛋白(EGFP用于評估轉(zhuǎn)染效率)陽性細胞約占33.10%,高于單純質(zhì)粒組(0.51%)和質(zhì)粒+超聲組(5.21%),實驗組區(qū)域內(nèi)促血管生成因子如HIF-1α、VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達增加;與對照組比較,實驗組細胞凋亡率降低,梗死瘢痕減少,毛細血管密度和心肌灌注增加。Sun等[30]將脯氨酰羥化酶結構域蛋白2(PHD2)shRNA修飾的骨髓干細胞在UTMD作用下輸入急性心肌梗死區(qū)域,可有效提高細胞存活率,增加血管再生。基質(zhì)細胞衍生因子1α(SDF-1α)已被證實是重要的干細胞趨化因子之一,在心肌梗死后,干細胞通過趨化作用進入到梗死心肌內(nèi)參與修復。SDF-1α/CXCR4通路在趨化過程發(fā)揮起著關鍵作用。Su等[31]研究顯示,在心肌梗死大鼠體內(nèi)運用UTMD轉(zhuǎn)染SDF-1α基因,轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)CXCR4 mRNA表達水平升高,外周血SDF-1α水平增高,骨髓間充質(zhì)干細胞向梗死區(qū)歸巢增多,且隨著SDF-1α表達的增加而增加,重復操作可循環(huán)增加。Yu等[32]研究進一步發(fā)現(xiàn)UTMD聯(lián)合phSDF-1α-核因子-κB(NF-κB)轉(zhuǎn)染可提高SDF-1α表達。Zhou等[33]研究顯示,在頻率4 MHz、脈沖頻率20 Hz的低強度超聲下,聯(lián)合微泡,在8、18、26周期的脈沖長度(PL)治療,結果顯示,DCM模型大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT-內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)信號通路被激活,血管細胞活力增強,促進血管生成,心功能改善,顯著抑制心肌纖維化;與對照組比較,UTMD脈沖長度為3個周期,聲壓級為50%,機械指數(shù)為0.82,治療時間為3 min,是增加血管內(nèi)皮細胞活力的最佳條件。Zhang等[34]研究顯示,UTMD可增強DCM大鼠的心肌血管活性,促進再生,其中以脈沖長度為26個周期的亞組效果最顯著。Zhu等[35]研究顯示,UTMD參與治療的心肌梗死大鼠體內(nèi)VEGF、eNOS表達及一氧化氮表達均升高,梗死面積較治療前縮小,射血分數(shù)較治療前升高,證實UTMD是一種潛在的治療心肌梗死的物理方法。Yu等[36]研究顯示,UTMD與亞硝酸鹽協(xié)同治療,通過增加eNOS恢復血管功能,同時亞硝酸鹽參與可防止氧化應激。

7 小結與展望

在難治性及藥物療效較差的心臟疾病(如難治性心力衰竭、心肌梗死后的恢復及冠狀動脈微血管再通等)治療方面,UTMD可作為一種將目標基因傳遞到活體動物器官的新療法,應用于心血管疾病中顯示出治療潛力,為難治性心臟病提供了一種治療新思路。盡管UTMD顯示出廣闊的應用前景,但該技術相關目標基因的選擇、微泡特定靶向能力、靶向顯影效果、提高靶向微泡的穿透能力及基因攜帶能力,超聲輻照的強度、時間及治療后產(chǎn)生的長期副作用等有待進一步研究。