付慧莉，程 戈

武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

微泡是一種增強心血管體系超聲成像信號的造影劑［1］。這種造影劑通常是直徑幾個微米、包覆生物惰性氣體的空心微球，具有脂質(zhì)或高分子（如血清蛋白、聚乙烯醇和聚酯等）的外殼［2-7］。當微泡分散到血液中，空腔內(nèi)的氣體會在超聲波的作用下周期性地收縮和膨脹、發(fā)出超聲波信號而被檢測［8］。微泡可作為超聲示蹤劑用于人體［9-11］，同時，也可作為藥物與生物活性氣體的載體［12-14］，在超聲波的輔助下通過形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化而進行藥物與生物活性氣體（如NO等）的傳遞和釋放。與脂質(zhì)微泡相比，高分子微泡具有固定的外殼，從而擁有在特定環(huán)境下優(yōu)良的穩(wěn)定性，如長期包覆儲存及傳遞生物活性氣體等。其中生物可降解聚酯微泡不僅能穩(wěn)定保持空腔內(nèi)的氣體，而且有可能通過調(diào)節(jié)聚酯外殼的降解而控制氣體的逸出。因此，聚酯微泡可以做為一種穩(wěn)定可控的生物活性氣體載體向人體內(nèi)傳遞釋放包覆的氣體，釋放的速率可通過調(diào)節(jié)聚酯外殼的降解速率來調(diào)控。本文用溶劑揮發(fā)界面沉積法制備了一種以聚己內(nèi)酯為外殼主體、核心包覆氮氣的空心微泡，并對微泡的結(jié)構(gòu)、形貌、粒徑分布、超聲成像和包覆氣體的持久性進行了表征，以驗證其做為生物活性氣體載體的可能性。

1 實驗部分

1.1 化學(xué)試劑與儀器

人血清白蛋白、乙酸異丙酯、環(huán)辛烷、戊二醛（Sigma-Aldrich），羧基端基聚ε-己內(nèi)酯（Mr=105）（Lakeshore Biomaterials），熒光染料 BODIPY493/503（Invitrogen）。

蠕動泵（Masterflex）；高速臺式離心機（Sig?ma）；AdventurePlus凍干機（Labconco）；Sequoia 512超聲診斷儀（Siemens Medical Solution）。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚己內(nèi)酯微泡的制備 本文制備的聚己內(nèi)酯微泡的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。微泡由溶劑揮發(fā)界面沉積法制備［15］，將聚己內(nèi)酯沉積在交聯(lián)的人血清白蛋白外網(wǎng)的內(nèi)側(cè)形成微泡的聚合物外殼，用以包覆核心氣體。具體操作為：將44 g含5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）聚己內(nèi)酯和13%環(huán)辛烷的乙酸異丙酯溶液加入到25 g含6%人血清白蛋白的水溶液中，用蠕動泵使該混合液通過微孔金屬濾芯進行乳化，所得乳液在350 g含0.1%戊二醛的水溶液中交聯(lián)固化為包覆溶劑液滴的微球，然后分裝入血清瓶，在凍干機中凍干并充入氮氣壓蓋封口保存。將熒光染料BODIPY493/503加入到聚己內(nèi)酯溶液中混合并用上述方法制備得到熒光聚己內(nèi)酯微泡。

圖1 聚己內(nèi)酯微泡的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of polycaprolactone microbubble structure

1.2.2 聚己內(nèi)酯微泡的結(jié)構(gòu)、形貌與粒徑分布表征 用生理鹽水將凍干的聚己內(nèi)酯微泡重新分散、洗滌、離心收集，并配制微泡懸浮液。將懸浮液滴加在載玻片上，加蓋蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀測微泡的結(jié)構(gòu)與粒徑分布。將微泡懸浮液中的微泡濾出，真空干燥噴金并通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）表征其形貌和結(jié)構(gòu)。通過CoulterCounter Multisizer III粒度分析儀對微泡懸浮液進行粒徑分布和濃度的檢測。

1.2.3 聚己內(nèi)酯微泡的超聲成像 將已知濃度的聚己內(nèi)酯微泡懸浮液稀釋并配制成一系列梯度濃度，將每一個濃度的微泡懸浮液裝入樣品室中，在預(yù)先除氣的水浴中通過超聲診斷儀進行微泡的超聲成像。成像使用15L8探頭、采用對比脈沖序列技術(shù)CPS 7MHz MI1進行。所得超聲顯影圖像中指定區(qū)域內(nèi)的微泡的平均信號強度由軟件Image J進行分析。

1.2.4 聚己內(nèi)酯微泡在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性表征 將微泡濃度為8.0×105mL-1的微泡懸浮液分裝入若干樣品室中，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育，在設(shè)定的不同時間點分別取出3個平行樣品，用上述方法進行超聲成像并分析圖像中指定區(qū)域內(nèi)的微泡的平均信號強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚己內(nèi)酯微泡的結(jié)構(gòu)與形貌

重新分散的聚己內(nèi)酯微泡漂浮在懸浮液的表層，表明因為包覆氣體使微泡的密度小于水，間接證明成功制備了微泡。聚己內(nèi)酯微泡的明場和熒光光學(xué)顯微鏡圖分別如圖2（a）和圖2（b）所示。圖2（a）中所制備的聚己內(nèi)酯微泡分散均勻，直徑為幾個微米，微泡中間呈透亮的白色，可以證明微泡為內(nèi)部中空的球型結(jié)構(gòu)；圖2（b）中混合熒光染料的聚己內(nèi)酯微泡外殼在光源的激發(fā)下發(fā)射出綠色熒光，微泡中部沒有熒光，表明內(nèi)部中空沒有聚合物和熒光染料，同樣證實了微泡的空心結(jié)構(gòu)。圖2（c）為聚己內(nèi)酯微泡的SEM圖，微泡的外殼完整，大體平滑，略帶褶皺，在真空干燥的制樣條件下，微泡內(nèi)部的氣體被抽出，外殼塌陷，進一步證明了所制備微泡的中空薄殼結(jié)構(gòu)，且微泡的粒徑為2 μm～3 μm，與光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果吻合。

2.2 聚己內(nèi)酯微泡的粒徑分布

微泡的粒徑分布如圖2（d）所示，微泡的粒徑尺寸分布在1 μm～10 μm，絕大部分集中在1 μm～5 μm之間，微泡的平均粒徑為2.2 μm。微泡的這一尺寸不僅可以使其做為心血管超聲造影劑在血管中自由通過，而且使其內(nèi)腔具有較大的容量，可儲存生物活性氣體。

圖2 聚己內(nèi)酯微泡：（a）明場光學(xué)顯微鏡圖（200X），（b）熒光光學(xué)顯微鏡圖（200X），（c）SEM圖，（d）粒徑分布圖Fig.2 Polycaprolactone microbubbles：（a）bright-field microscopic image（200X），（b）fluorescence microscopic image（200X），（c）SEM image，（d）size distribution

2.3 聚己內(nèi)酯微泡的濃度與超聲成像信號強度的關(guān)系

聚己內(nèi)酯微泡的濃度與超聲成像信號強度的關(guān)系如圖3（a）所示。在微泡濃度處于103mL-1至107mL-1之間時，隨著微泡濃度增加超聲成像信號逐漸增強，從0.3 dB增強到24.4 dB。其中，當微泡濃度處于104mL-1和106mL-1之間時，超聲成像信號強度隨著微泡濃度的增加明顯增強，從1.6 dB增強到23.5 dB。微泡濃度增加至107mL-1時，超聲顯影圖像信號強度增強緩慢，趨于飽和。

2.4 聚己內(nèi)酯微泡生理環(huán)境下的穩(wěn)定性

圖3（b）給出了在37℃培養(yǎng)箱中孵育長達14 d的聚己內(nèi)酯微泡的超聲成像信號強度。由圖3（b）可知，在持續(xù)14 d的孵育中，微泡的超聲顯影信號強度與孵育之前相比沒有明顯的變化，孵育14 d后的微泡超聲成像信號強度（23.4±1.3）dB與孵育前的信號強度（22.3±0.5）dB相比沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異（概率大于0.05）。微泡的超聲信號是由微泡內(nèi)所包覆的氣體在超聲波的作用下震動所產(chǎn)生，微泡的超聲信號穩(wěn)定，表明微泡所包覆的氣體仍然穩(wěn)定存在，沒有逸出。這一結(jié)果表明至少在14 d內(nèi)微泡可做為穩(wěn)定的超聲示蹤劑，也可做為穩(wěn)定的藥物和生物活性氣體載體。

圖3 聚己內(nèi)酯微泡的超聲成像信號強度與（a）濃度，（b）孵育時間的關(guān)系Fig.3 Relationship between video intensity of polycaprolactone microbubbles and（a）microbubble concentration，（b）incubation time

3 結(jié) 語

本文用溶劑揮發(fā)界面沉積法成功制備了以聚己內(nèi)酯為外殼主體、核心包覆氮氣、平均粒徑為2.2 μm的微泡，并通過超聲成像對微泡在生理條件下包覆核心氣體的穩(wěn)定性進行了表征。結(jié)果表明聚己內(nèi)酯微泡能夠穩(wěn)定包覆核心氣體至少14 d，具備成為優(yōu)質(zhì)超聲示蹤劑和藥物與生物活性氣體載體的潛力。