葛祥武

摘 要：本文建立了QuEChERS技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定人參及其種植土壤中4種三唑類農(nóng)藥殘留的分析方法。人參和土壤樣品加水經(jīng)乙腈提取，采用QuEChERS提取鹽包進行鹽析、凈化后，采用LC-MS/MS進行檢測。選用C18色譜柱進行分離，采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式，外標(biāo)法定量。4種目標(biāo)化合物在一定的含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2≥0.991 5），低、中、高水平加樣回收率為90.1%～104.1%，RSD為3.2%～8.6%，定量下限為0.01 mg·kg-1；對30批樣品進行測定，農(nóng)藥檢出率為83.3%。該方法高效、靈敏、準(zhǔn)確，適用于人參及其種植土壤中多種農(nóng)藥的快速篩查和定量檢測，具有較強的實用價值。

關(guān)鍵詞：QuEChERS；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；人參和土壤；農(nóng)藥殘留；三唑類

Determination of Four Triazole Pesticide Residues in Ginseng and the Planting Soil by QuEChERS-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GE Xiangwu

（Dalian Center for Food and Drug Control and Certification， Dalian 116037， China）

Abstract： In this paper， QuEChERS technique combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed for the simultaneous determination of 4 triazole pesticides residues in ginseng and its planting soil. Ginseng and soil powder was treated with water and extracted with acetonitrile， salted out by the QuEChERS package and purified， then detected by LC-MS/MS. C18 column was selected for the separation， electron spray ion source was applied with multiple reaction monitoring modes， external standard method was used for quantification. The 4 target compounds showed good linearity within a certain content range（r2≥0.991 5）. Under the low， medium， and high addition levels， the recoveries were in the range of 90.1%～104.1%， with the relative standard deviations within 3.2%～8.6%， and the limits of quantitation for the 4 compounds were 0.01 mg·kg-1. Thirty batches of ginseng and soil samples were tested and the detection rate of pesticide was 83.3%. The detecting method is efficient， sensitive， and accuracy， which can be used for rapid screening and quantitative detection of various pesticide residues in ginseng and the planting soil， and has strong practical value.

Keywords： QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; ginseng and soil; pesticide residues; triazole

人參（Ginseng）作為一種珍貴的中草藥，不僅能夠提高人體免疫能力，而且對神經(jīng)類疾病、糖尿病、心血管類疾病等有良好的治療和預(yù)防效果[1-2]。隨著人們生活水平的提高，人參開始作為保健品食用，市場需求量大增，人參種植農(nóng)戶也越來越多[3]。人參作為多年生植物，易遭受病蟲害，為保產(chǎn)量和質(zhì)量，農(nóng)藥使用必不可少。人參每年春季出苗展葉期易染銹病，1～3年生人參發(fā)病較重，防治不當(dāng)可能導(dǎo)致表皮產(chǎn)生裂紋，須根枯死，莖葉萎蔫，參根隨之腐爛，造成嚴(yán)重?fù)p失。為防治銹病，常在每年春季出苗展葉期施用三唑類農(nóng)藥[4]。三唑類殺菌劑是指含有1，2，4-三唑環(huán)的化合物，因其具有穩(wěn)定性高、半衰期長、不易生物降解、易在環(huán)境中擴散等特點，所以在各種環(huán)境介質(zhì)中被廣泛檢出[5-6]。長期濫用農(nóng)藥不僅會導(dǎo)致農(nóng)藥在土壤、水中蓄積，也會影響人們的身體健康。因此，開發(fā)靈敏、高效的農(nóng)藥多組分殘留分析方法，用以檢測人參及其種植土壤中這些化合物的實際殘留水平，不僅能夠有效監(jiān)控環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，指導(dǎo)合理用藥，而且可以進一步保障種植產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

目前尚未見同時檢測人參及其種植土壤中三唑類殺菌劑殘留的報道，本研究選取在人參種植中經(jīng)常使用且檢出率較高的4種三唑類殺菌劑（苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟環(huán)唑、戊唑醇）[7-9]為目標(biāo)化合物，探討并建立同時檢測人參及其種植土壤中此類殺菌劑殘留的方法。QuEChERS前處理方法于2003年首次被提出，與傳統(tǒng)的固相萃取柱凈化法相比，具有提取速度快、溶劑用量少、樣品制備簡便等眾多優(yōu)點，在農(nóng)藥殘留分析檢測中得到越來越廣泛的應(yīng)用[10-12]。檢測三唑類農(nóng)藥殘留采用QuEChERS處理樣品，凈化效果好，速度快[13-14]。本文采用QuEChERS前處理方法結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能夠快速準(zhǔn)確地分析人參及其種植土壤中三唑類殺菌劑殘留，前處理操作簡單、快速、成本低，適合大批量樣品的快速定性及定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC XEVO TQ-S液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美國Waters公司；NU-C200R-E型高速冷凍離心機，美國NuAire公司；MMS-5020型振蕩器，日本Eyela公司；分析天平，奧豪斯儀器有限公司；高速萬能粉碎機，天津泰斯特。

苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟環(huán)唑和戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（Optima LC/MS），美國Thermo Fisher公司；QuEChERS提取包（1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸氫二鈉、1 g檸檬酸鈉），QuEChERS分散凈化包，美國Agilent公司。

1.2 樣品來源及處理

30批樣品采集自遼寧省撫順市新賓縣、本溪市桓仁縣和丹東市寬甸縣，每個基地隨機選取同時種植的3年生人參5株，對應(yīng)植株下土壤樣品5份（每份500 g）。15批鮮人參和15批土壤，編號分別為G1～G15和S1～S15。人參新鮮樣品收集后，用軟毛刷刷洗干凈，切片，于40 ℃烘箱中烘干72 h，后經(jīng)高速萬能粉碎機粉碎，過2號篩，裝袋密封；土壤樣品風(fēng)干，過1 mm 篩，樣品于4 ℃保存，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液制備

分別精確稱取5 g人參及土壤樣品，放置于50 mL離心管中，先加入10 mL水，渦旋混勻后靜置10 min，再加入乙腈10 mL、QuEChERS提取包及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min，4 200 r·min-1離心5 min。吸取6 mL上清液于15 mL離心管中（預(yù)先裝有分散凈化包及1顆陶瓷均質(zhì)子），劇烈振蕩1 min，4 200 r·min-1離心5 min。取1 mL上清液過0.22 μm微孔濾膜，用于LC-MS/MS測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。將質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。使用前再分別移取4種質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃保存。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。準(zhǔn)確移取適量1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.005 mg·L-1、0.010 mg·L-1、0.020 mg·L-1、0.050 mg·L-1、0.100 mg·L-1和0.500 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（3）基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取不含4種供試農(nóng)藥的空白人參和土壤樣品，按照“1.3.1”項方法進行空白基質(zhì)溶液的制備，進一步配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 μm微孔濾膜。

1.4 檢測條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序：0～1.5 min，90% A；1.5～5.0 min，90%→50% A；5.0～7.0 min，50%→30% A；7.0～8.0 min，30%→10% A；8.0～10.0 min，10% A；10.1～12.0，90% A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓：3 kV；去溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔氣流：150 L·h-1。4種目標(biāo)分析物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1，TIC圖見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

本文分別考察了丙酮、甲醇、乙腈對目標(biāo)物提取效率的影響。如表2所示，乙腈對人參及土壤中的目標(biāo)化合物的提取效果相對較好，共提物雜質(zhì)較少，回收率均接近100%，因此最終選取乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化材料的選擇

采用A（1 200 mg MgSO4+400 mg PSA）、B（1 200 mg MgSO4+400 mg PSA+400 mg C18）、C（885 mg MgSO4+150 mg PSA+15 mg GCB）、D（885 mg MgSO4+150 mg PSA+45 mg GCB）4種不同組成的QuEChERS分散凈化包進行凈化，通過回收率比較這4種凈化材料的凈化效果。如圖2所示，4種凈化包對于目標(biāo)化合物的回收率均在70%以上，但使用凈化包C和D的目標(biāo)物回收率偏低，可能是因為這兩種凈化包中含有一定含量的GCB，GCB可以有效凈化色素類雜質(zhì)，但也對一些平面結(jié)構(gòu)的目標(biāo)物造成了嚴(yán)重吸附，如苯醚甲環(huán)唑。使用凈化包A和B后，人參及土壤樣品中4種農(nóng)藥都有較好的回收，使用凈化材料A得到的回收率更接近100%，因此本方法選用分散凈化包A作為最終凈化材料。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 空白試驗

除不加樣品外，按“1.3.1”項供試品溶液制備方法制得空白溶液，經(jīng)分析，實驗過程和方法對4種農(nóng)藥的分析檢測均無干擾。

2.3.2 線性范圍和定量下限

在優(yōu)化條件下測定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），進行線性回歸，得相關(guān)系數(shù)r2均≥0.991 5，見表3。通過在空白基質(zhì)中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行加標(biāo)回收實驗的方式，以滿足方法學(xué)要求的最低添加回收水平為定量下限（Lower Limits of Quantification，LLOQ）[15]。4種農(nóng)藥的LLOQ為0.01 mg·kg-1，在該水平下的平均回收率為90.5%～103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）均低于7.9%，表明該定量下限滿足方法學(xué)驗證要求。

2.3.3 回收率和精密度

按“1.3.1”項試驗方法對人參及種植土壤樣品分別進行低、中、高3個水平的添加，回收率和精密度測定結(jié)果見表4。在3個添加水平下，4種農(nóng)藥的回收率在90.1%～104.1%，RSD在3.2%～8.6%（n=6），說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1）×100%，基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果為負(fù)數(shù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，結(jié)果為正數(shù)表示基質(zhì)增強效應(yīng)。結(jié)果在-20%～20%為弱基質(zhì)效應(yīng)；在-50%～-20%和20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；超過-50%或50%為強基質(zhì)效應(yīng)。計算得出基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3，4種農(nóng)藥均存在弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，為更準(zhǔn)確地定量，仍使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行計算。

2.4 實際樣品測定

應(yīng)用本研究優(yōu)化后的方法，對30批樣品中4種三唑類殺菌劑進行測定，結(jié)果見表5。農(nóng)藥殘留總檢出率為83.3%，人參樣品中農(nóng)藥殘留檢出率為80.0%，土壤樣品中農(nóng)藥殘留檢出率為86.7%。在30批次樣本中，5（16.7%）批次樣本僅檢出1種三唑類殺菌劑，20（66.7%）批次樣本檢出2～4種三唑類殺菌劑。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[16]中的規(guī)定，在15批次人參樣本檢測中，苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇無超標(biāo)情況，5批人參丙環(huán)唑殘留量超標(biāo)，其安全性不容忽視。同時測定發(fā)現(xiàn)土壤中農(nóng)藥殘留量高于人參中農(nóng)藥殘留量，且殘留量較高，檢出值多在0.016～0.250 mg·kg-1，說明三唑類殺菌劑在土壤中不容易分解，長期使用會在土壤中累積，存在安全隱患。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定藥食兩用中藥材人參及其種植土壤中三唑類農(nóng)藥殘留的分析方法，該方法具有良好的專一性、廣泛的線性，操作簡單、靈敏度高，為多種類樣品的質(zhì)量監(jiān)控提供方法參考，解決了傳統(tǒng)單一檢測種植產(chǎn)品農(nóng)藥殘留而生長環(huán)境監(jiān)控滯后的問題。人參及種植土壤中三唑類檢出率較高，農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全問題已經(jīng)顯現(xiàn)，推進植物源性食品、中藥種植綠色防控技術(shù)迫在眉睫。

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