李銘

[摘要] 目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的方法。 方法 色譜條件采用Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.2%冰乙酸（70︰30）為流動(dòng)相，流速為0.3 ml/min。質(zhì)譜檢測(cè)采用正離子電噴霧離子源（ESI+），在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下檢測(cè)，監(jiān)測(cè)離子（m/z）分別為：144/58、144/84。 結(jié)果 鹽酸水蘇堿濃度在0.2～10.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9992），平均回收率為102.6%，RSD為1.5%（n=6）。 結(jié)論 該方法快速簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于益母草顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 益母草顆粒；鹽酸水蘇堿；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）01（b）-0008-03

Content of stachydrine hydrochloride from Motherwort granule determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LI Ming

Institute for Food and Drug Control of Beihai in the Guangxi Zhuang Autonomous Region，Beihai 536000，China

[Abstract] Objective To establish a method of high performance liquid chromatography （HPLC）-tandem mass spectrometry determining the content of stachydrine hydrochloride from Motherwort granule. Methods The chromatographic conditions were Agilent SB-C18 column （50 mm×2.1 mm，1.8 μm），acetonitrile to 0.2% glacial acetic acid （70︰30） as the mobile phase，and a flow rate of 0.3 ml/min.Positive ion electrospray ionization（ESI+） was applied for mass spectrometric detection under multiple reaction monitoring（MRM） mode.The monitored ions （m/z） was 144/58，144/84 respectively. Results The concentration of stachydrine hydrochloride being within 0.2 μg/ml to 10.0 μg/ml had a good linear relationship with the peak area.The r value was 0.9992，and the average recovery was 102.6% and the value of RSD was 1.5%（n=6）. Conclusion The method is fast，simple，specific，and accurate in outcome，which can be used for quality control of Motherwort granule.

[Key words] Motherwort granule；Stachydrine hydrochloride；High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

益母草顆粒是由益母草水提取物為主要原料加蔗糖、糊精等輔料經(jīng)適當(dāng)加工而成的婦科常用中成藥，具有活血調(diào)經(jīng)止痛等功能，臨床上用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛及產(chǎn)后惡露不絕、經(jīng)量少、淋漓不凈、產(chǎn)后出血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全等。益母草中的主要活性成分為鹽酸水蘇堿。益母草顆粒為《中國(guó)藥典》2010年版一部收載品種[1]，其對(duì)益母草中的鹽酸水蘇堿含量測(cè)定采用薄層色譜掃描。該方法影響因素多，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差。部分文獻(xiàn)[2-20]采用高效液相色譜法，選用紫外檢測(cè)器[2-14]、蒸發(fā)光檢測(cè)器[15-19]、示差折光檢測(cè)器[20]測(cè)定益母草制劑中鹽酸水蘇堿的含量。其大多數(shù)使用較特別的色譜柱，如氨基色譜柱、磺酸基陽(yáng)離子交換色譜柱、丙烯酰胺色譜柱，且樣品提取過(guò)程復(fù)雜，操作不簡(jiǎn)便。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，利用質(zhì)譜較高的選擇性和專一性，只用普通的C18反相色譜柱，只需簡(jiǎn)單的超聲提取即能完成對(duì)益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的測(cè)定，而該方法國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)未被報(bào)道過(guò)。測(cè)定結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

美國(guó)Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent 6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；AX205DU電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SK250超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)儀器有限公司，250 W，35 kHz）。

鹽酸水蘇堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究所，含量：99.0%，批號(hào)：110712-201010）供含量測(cè)定用；益母草顆粒（A廠：批號(hào)130304；B廠：批號(hào)140402；C廠：批號(hào)130402），為市售品；乙腈為色譜純，水為市售娃哈哈純凈水，冰乙酸為優(yōu)級(jí)純，其余檢測(cè)用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰乙酸（70︰30）；流速為0.3 ml/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為大氣壓電噴霧離子源（ESI源），選擇掃描方式為正離子，采用全掃描、選擇離子掃描及二級(jí)全掃描；霧化氣壓力：30 Psi（1 Psi=6890 Pa），干燥氣溫度：300℃，輔助氣（N2）流速：8.0 L/min，離子源Vcap毛細(xì)管電壓：4000 V，含量測(cè)定監(jiān)測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），鹽酸水蘇堿定性離子質(zhì)荷比（m/z）144/84，定量離子質(zhì)荷比144/58；定性和定量離子對(duì)應(yīng)的碰撞能量壓分別為22、26 V，碎裂電壓均為128 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸水蘇堿對(duì)照品12.55 mg，置25 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.497 mg/ml對(duì)照品貯備溶液。精密量取對(duì)照品貯備液1 ml，置25 ml量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為19.9 μg/ml的對(duì)照品使用溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5包顆粒內(nèi)容物，研細(xì)混勻，稱取約5 g重量，精密稱定，置50 ml量瓶中，加70%乙醇約40 ml，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，取出放冷至室溫，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻、過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液2 ml置100 ml量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按藥品標(biāo)準(zhǔn)中的處方比例和制法制備不含益母草的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法操作制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性考察試驗(yàn)

精密量取上述對(duì)照品使用溶液，供試品溶液，陰性對(duì)照溶液各5 μl注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按上述色譜及質(zhì)譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果鹽酸水蘇堿的保留時(shí)間約為3.5 min，溶液內(nèi)的其他雜質(zhì)不干擾樣品中的鹽酸水蘇堿分離測(cè)定，陰性樣品在鹽酸水蘇堿色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間處未見(jiàn)干擾峰出現(xiàn)，表明方法的專屬性良好（圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

精密量取上述對(duì)照品使用溶液0.1、0.5、1、2、5 ml分別置10 ml容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品液。取每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品液各5 μl分別注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，進(jìn)行線性考察。以濃度（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=31.96X+3.94×103（r=0.9992）。結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿在0.2～10.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：130304）共6份，按供試品溶液的制備方法平行配制6份供試品溶液，同法測(cè)定，測(cè)得平均含量為6.0265 mg/g，RSD為1.67%，表明方法有較好的重復(fù)性。

2.6 精密度試驗(yàn)

取鹽酸水蘇堿對(duì)照品使用溶液5 μl，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果峰面積的RSD為0.77%，表明分析方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液5 μl，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、20 h按上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果鹽酸水蘇堿峰面積RSD為1.1%，表明在20 h內(nèi)供試品溶液中鹽酸水蘇堿峰面積無(wú)明顯變化，供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)：130304）的已知含量樣品5包，取顆粒研細(xì)混勻，稱取6份約2.5 g細(xì)粉，精密稱定，分別置50 ml量瓶中，分別精密加入鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，分別加70%乙醇約40 ml，超聲處理20 min，取出放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻、過(guò)濾，分別取續(xù)濾液2.00 ml，用70%乙醇定容至100 ml量瓶，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為回收率測(cè)定的供試品溶液。再按上述色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸水蘇堿峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為102.6%，RSD為1.5%（表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同生產(chǎn)廠家樣品3批，按上述供試品溶液的制備方法配制供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，代入線性方程計(jì)算含量。3個(gè)廠家3個(gè)批號(hào)樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 提取時(shí)間的選擇

在供試品溶液的制備上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同超聲的提取時(shí)間（10、20、30、40 min）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，超聲提取20 min已將樣品中的鹽酸水蘇堿提取完全。

3.2 流動(dòng)相比例的選擇

在流動(dòng)相的選擇上，流動(dòng)相中乙腈與0.2%冰乙酸的比例經(jīng)過(guò)多次配比試驗(yàn)，當(dāng)乙腈︰0.2%冰乙酸=70︰30時(shí)樣品中的其他成分對(duì)鹽酸水蘇堿的測(cè)定無(wú)干擾，且鹽酸水蘇堿的出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形、理論塔板數(shù)均較理想，故選用該比例進(jìn)行測(cè)定。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

在對(duì)質(zhì)譜條件的優(yōu)化考察中，為使鹽酸水蘇堿的各子離子峰信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，以正、負(fù)離子模式分別進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描并通過(guò)優(yōu)化裂解電壓以及碰撞能壓，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)達(dá)到最佳的質(zhì)譜條件。

3.4 本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)

益母草顆粒的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定采用薄層色譜掃描法測(cè)定，其處理較為繁瑣，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，而高效液相色譜法，色譜柱選擇要求條件高，樣品提取過(guò)程復(fù)雜，部分方法采用檢測(cè)器靈敏度低。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量，具有較高的選擇性和專一性，靈敏度高，色譜柱選擇較普通常用，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。

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（收稿日期：2015-06-09 本文編輯：王紅雙）