郭張虹 張楊 陳銀海

摘 要：目的：建立一種測定粿條中脫氫乙酸的高效液相色譜方法。方法：在樣品中加入水、硫酸鋅溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，搖勻，超聲提取后加水定容并高速離心，取適量上清液過濾，用高效液相色譜儀測定，檢測波長293 nm。結(jié)果：在流動(dòng)相設(shè)定為0.02 mol·L-1乙酸銨（pH值調(diào)節(jié)至8.0）∶甲醇=90∶10的條件下，脫氫乙酸的峰形對稱、無拖尾現(xiàn)象；脫氫乙酸響應(yīng)強(qiáng)度與濃度（1～200 μg·mL-1）之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)性系數(shù)R2=0.999 98。測定的加標(biāo)回收率為84.3%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～2.90%。結(jié)論：該方法處理過程簡便、準(zhǔn)確度高，具有良好的重現(xiàn)性，能夠準(zhǔn)確測定粿條中脫氫乙酸的含量，易在基層檢測機(jī)構(gòu)推廣，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；粿條；脫氫乙酸

Determination of Dehydroacetic Acid in Rice Noodles by HPLC

GUO Zhanghong， ZHANG Yang， CHEN Yinhai

（Center for Disease Control and Prevention of Shantou City， Shantou 515041， China）

Abstract： Objective： This paper aims to establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of dehydroacetic acid in rice noodles. Method： The samples were added with water， zinc sulfate solution and then adjust pH with sodium hydroxide solution， shake well before ultrasonic extraction， finally the samples were added with water to a constant volume and then centrifuged at a high speed. The supernatant was filtered and then determined by HPLC at 293 nm. Result： Under the condition of mobile phase 0.02 mol·L-1 ammonium acetate∶methanol=90∶10 and the pH value of ammonium acetate adjusted to 8.0， the peak shape of dehydroacetic acid is symmetrical without trailing phenomenon. Within the concentration range of 1～200 μg·mL-1， the linear relationship between the response strength and the concentration of dehydroacetic acid was good， and the linear correlation coefficient of the target substance was 0.999 98. The recovery rates of the samples were 84.3%～106.0%， and the relative standard deviations were 2.37%～2.90%. Conclusion： The method has simple and convenient operation， high accuracy and good reproducibility， and is suitable for the accurate determination of dehydroacetic acid in rice noodles， which is easily to promoted in grass-roots testing institutions and has practical application value.

Keywords： high performance liquid chromatography; rice noodles; dehydroacetic acid

脫氫乙酸是一種廣譜高效的防腐劑，能殺滅微生物或抑制其繁殖以達(dá)到防腐效果，可減緩食品變質(zhì)，降低經(jīng)濟(jì)損失[1]。脫氫乙酸及其鈉鹽在世界衛(wèi)生組織化學(xué)物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)中屬于低毒級別，對人體健康存在潛在威脅[2]，因此我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了脫氫乙酸及其鈉鹽在食品中的使用范圍和最大使用量[3]。盡管有明確規(guī)定，但部分食品生產(chǎn)商為了能延長食品保鮮保質(zhì)時(shí)間、追求經(jīng)濟(jì)效益最大化，依然會(huì)超范圍或超劑量使用脫氫乙酸，危害人體健康[4-5]。粿條是潮汕地區(qū)的傳統(tǒng)特色小吃，深受大眾喜愛，含有碳水化合物和蛋白質(zhì)等豐富的營養(yǎng)成分，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，商家為了延長粿條的保質(zhì)期和保鮮期會(huì)添加脫氫乙酸，因此需要對粿條中脫氫乙酸含量進(jìn)行監(jiān)測，為消費(fèi)者的食品安全提供保障。

目前食品中脫氫乙酸的檢測方法主要有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6]、氣相色譜法[7]、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等，其中HPLC法能實(shí)現(xiàn)對脫氫乙酸的定量分析，且易在基層檢測機(jī)構(gòu)中推廣。因此，本文以汕頭市售粿條為樣品，利用HPLC法簡單快捷檢測脫氫乙酸，為今后高效快速檢測粿條或類似樣品中的脫氫乙酸提供較強(qiáng)的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：粿條，購自汕頭本地市場。

試劑：脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，CDAA-263002-1g，購自上海安譜公司；硫酸鋅溶液（120 g·L-1）：稱取120 g硫酸鋅，用水稀釋至1 L；氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）：稱取200 g氫氧化鈉，用水稀釋至1 L；乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，用水稀釋至1 L；甲醇：色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配置DAD檢測器和OpenLAB工作站）；安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；UW220H電子天平，日本島津科學(xué)儀器公司；潔康多功能超聲波清洗機(jī)；梅特勒托利多pH計(jì)；H1850R臺式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀公司；0.22 μm針式水相濾膜，上海安譜公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用10 mL氫氧化鈉溶液溶解，并用水定容至刻度線得到脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg·mL-1）。分別準(zhǔn)確吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、10 mL和20 mL，加入100 mL容量瓶中，分別用水定容至刻度線，配制成系列濃度分別為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 儀器條件

本實(shí)驗(yàn)選用安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱；流動(dòng)相：0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=90∶10；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：293 nm。

1.3.3 樣品前處理

用高速均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱取約5 g（精確至0.001 g）樣品置于50 mL離心管中，依次加入10 mL水和5 mL硫酸鋅溶液，用氫氧化鈉溶液將樣品的pH值調(diào)節(jié)為7～8，搖勻，超聲提取20 min，加水定容至50 mL，搖勻，以10 000 r·min-1離心5 min，取適量上清液經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后供高效液相色譜儀測定。

1.3.4 流動(dòng)相pH值的調(diào)節(jié)

用氫氧化鈉溶液將流動(dòng)相乙酸銨溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.5、8.0、8.5共3個(gè)水平，與未調(diào)節(jié)pH值生成的峰形進(jìn)行比較，確定合適的流動(dòng)相pH值。

1.3.5 精密度和準(zhǔn)確度

選用基質(zhì)空白粿條樣品作為本底，同一樣品設(shè)置3份，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，形成3個(gè)不同含量的加標(biāo)水平，按照前處理方法及上機(jī)條件進(jìn)行測定，檢測脫氫乙酸的含量。每個(gè)濃度做7組平行實(shí)驗(yàn)，測定并計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而考察該方法的精密度和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相pH值對脫氫乙酸峰形的影響

由圖1可知，沒有調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值時(shí)，目標(biāo)峰拖尾、峰形不對稱，不利于定量分析。將流動(dòng)相pH值調(diào)節(jié)至7.5時(shí)，峰形有較大改善，拖尾現(xiàn)象也大幅減緩。繼續(xù)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值至8.0，此時(shí)峰形良好，峰尖銳且對稱，基本無拖尾現(xiàn)象，能夠準(zhǔn)確對脫氫乙酸進(jìn)行定量分析。當(dāng)流動(dòng)相pH值繼續(xù)調(diào)節(jié)至8.5時(shí)，能夠看出與pH=8.0時(shí)的峰形相比并無顯著差別。以上結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相pH值對脫氫乙酸的峰形影響很大，在一定范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，峰形越好，拖尾現(xiàn)象越不明顯。當(dāng)流動(dòng)相pH值達(dá)到8.0～8.5時(shí)，峰形良好，繼續(xù)升高流動(dòng)相pH值，峰形無顯著變化，考慮保護(hù)色譜柱的原則，該實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相pH=8.0作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.3.1配制的脫氫乙酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.2的實(shí)驗(yàn)條件上機(jī)測定，得到線性回歸方程為Y=30.705 52X+3.980 04，其線性相關(guān)性系數(shù)R2為0.999 98，脫氫乙酸峰面積（響應(yīng)值）與濃度在1～200 μg·mL-1下呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 方法精密度和準(zhǔn)確度

在基質(zhì)空白粿條樣品（本底值為0）中分別添加0.30 g·kg-1、0.60 g·kg-1、0.80 g·kg-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將3組處理好的不同水平的加標(biāo)粿條樣品溶液在上述實(shí)驗(yàn)條件下依次上機(jī)測定脫氫乙酸含量，根據(jù)結(jié)果計(jì)算平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表1可知，在該實(shí)驗(yàn)條件下測定粿條中脫氫乙酸的加標(biāo)回收率為84.3%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～2.90%，滿足定量分析的要求，說明此方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、可信度高。

2.4 樣品分析

在汕頭當(dāng)?shù)厥袌鲭S機(jī)抽取了280份新鮮粿條，應(yīng)用該方法檢測脫氫乙酸含量。其中，250份檢出有脫氫乙酸，檢出率接近90%，說明本地粿條中普遍添加脫氫乙酸。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)探討了利用HPLC法檢測粿條中脫氫乙酸的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在流動(dòng)相設(shè)為0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=90∶10，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值至8.0時(shí)，能有效分離脫氫乙酸與其他干擾峰，改善脫氫乙酸的峰形，緩解拖尾現(xiàn)象，說明流動(dòng)相pH值對脫氫乙酸的峰形有重要影響。脫氫乙酸解離常數(shù)（pKa）為5.4[9]，流動(dòng)相的理論pH值大于pKa值+2或小于pKa值-2時(shí)能以分子形式或離子形式穩(wěn)定存在，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)可根據(jù)樣品種類不同調(diào)節(jié)脫氫乙酸流動(dòng)相的pH值為8.0～8.5，從而獲得良好的分析效果。對粿條進(jìn)行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，得到的加標(biāo)回收率為84.3%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～2.90%，說明此方法具有一定可操作性，可準(zhǔn)確測定粿條樣品中脫氫乙酸的含量。

汕頭市售粿條脫氫乙酸的檢出率高，脫氫乙酸添加情況普遍，相關(guān)食品安全部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管，確保防腐劑的適量、科學(xué)添加，為這一傳統(tǒng)食品的健康發(fā)展提供強(qiáng)有力的支撐，保障消費(fèi)者的食品安全。

參考文獻(xiàn)

[1]陳小萍，龔劭剛.脫氫乙酸的合成與應(yīng)用[J].化工時(shí)刊，2005，19（4）：7-8.

[2]張蒙，陳新，張雨梅.脫氫乙酸鈉對大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響[C]//第十次全國毒理學(xué)大會(huì)論文集.北京：中國毒理學(xué)會(huì)，2023：1.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 2760—2014[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[4]張維蔚，劉于飛，梁伯衡，等.廣州市米粉制品超范圍使用脫氫乙酸情況調(diào)查及居民暴露水平分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2018，28（18）：2293-2295.

[5]劉峰，徐飛，袁秀娟，等.一起牛奶中脫氫乙酸鈉中毒事件調(diào)查分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2019，31（5）：490-493.

[6]梁健華，謝珊婷，陳雪明.一種快速測定食醋和醬油中脫氫乙酸含量的高效液相色譜法[J].中國食品添加劑，2023，34（1）：313-319.

[7]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定：GB 5009.121—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[8]李梅，陳浩明，關(guān)智維.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對食品中10種甜味劑和防腐劑的檢測[J].廣東化工，2021，48（8）：271-274.

[9]SCORDINO M，LAZZARO F，BORZI M A，et al.Dehydroacetic acid in cheese and cheese coating，results of official control in Italy[J].Food Additives & Contaminants，2018，11（1）：75-81.