陳欣楠,李增艷

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

1 糖尿病腎病(DN)發(fā)病機(jī)制介紹

糖尿病腎病(DN)既是世界范圍內(nèi)誘發(fā)終末期腎病的主要病因,也是2型糖尿病主要的微血管并發(fā)癥[1]。DN的主要病理特征是系膜擴(kuò)張、足細(xì)胞丟失、基底膜增厚,腎小球和腎小管細(xì)胞損傷,進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化,其終點(diǎn)是不可逆的腎功能衰竭[2]。DN的確切機(jī)制非常復(fù)雜,涉及多種不同的細(xì)胞、分子、和因素。

高血糖及其下一步代謝產(chǎn)物,血流動(dòng)力學(xué)的改變、氧化應(yīng)激和多種信號(hào)通路的激活被認(rèn)為是DN細(xì)胞損傷和細(xì)胞外基質(zhì)過剩的驅(qū)動(dòng)因素并發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。

TGF-β和Wnt都是調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)的至關(guān)重要通路。大量研究表明,TGF-β/Smad信號(hào)通路是腎臟纖維化中著名的原纖維化通路,在DN的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。除TGF-β/Smad通路外,許多非Smad通路如PI3K/Akt、p38 MAPK、JAK/STAT等也參與DN的發(fā)生[4-6]。雖然這些分子和途徑已被確定,但DN的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前也沒有令人滿意的治療方式。因此,新的信號(hào)通路在DN研究中引起了廣泛的關(guān)注。目前,越來越多的研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一種多功能通路,參與了腎細(xì)胞損傷,包括系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞損傷,該通路也與DN腎小管間質(zhì)纖維化相關(guān)[7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在DN進(jìn)展中的作用引起了人們的關(guān)注。

2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在DN中的作用機(jī)制

Wnt家族蛋白屬于一類分泌型脂質(zhì)修飾糖蛋白,其氨基酸序列中含有高度保守的半胱氨酸殘基。在哺乳動(dòng)物物種中,有19種不同的Wnt蛋白被證實(shí)可誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路。目前已知,分泌的Wnt分子可以結(jié)合細(xì)胞表面受體,如脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)。最典型的Wnt信號(hào)通路是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。在非活性條件下,β-catenin與軸蛋白和腺瘤性息肉病大腸桿菌(APC)結(jié)合,并與糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)相互作用,使其N端殘基磷酸化,進(jìn)而導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的β-catenin的蛋白酶體降解[8]。當(dāng)Wnt蛋白結(jié)合到其跨膜受體卷曲受體家族蛋白(Fzd),以及協(xié)同受體,低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5和6 (LRP-5/6)時(shí),Wnt信號(hào)通路被激活。作為Wnt蛋白與其受體結(jié)合的結(jié)果,Wnt信號(hào)被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)磷蛋白Disheveled (Dsh/Dvl)。隨后,Wnt信號(hào)分為經(jīng)典β-catenin依賴通路或非經(jīng)典β-catenin獨(dú)立通路。在β-catenin依賴通路中,一旦Dvl被磷酸化,它就會(huì)抑制“破壞復(fù)合物”。這導(dǎo)致通過破壞復(fù)合體和泛素介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白水解降解來防止磷酸化。因此,未磷酸化的β-catenin穩(wěn)定并在細(xì)胞質(zhì)中積累,最后易位到細(xì)胞核中,與取代Groucho的TCF/LEF結(jié)合,并刺激下游靶基因Wnt的轉(zhuǎn)錄[8]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種Wnt信號(hào)通路的分泌蛋白拮抗劑,包括分泌卷曲相關(guān)蛋白(sFRPs)和Dickkopf (DKK)蛋白,它們被認(rèn)為是Wnt/β-catenin通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[8]。大量研究表明,Wnt配體通過細(xì)胞膜表面的結(jié)合受體在多個(gè)器官和細(xì)胞中發(fā)揮功能,包括器官生長(zhǎng)、腫瘤的發(fā)生以及纖維化等[9]。有報(bào)道Wnt通路可以與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)/Smad、Notch通路和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)進(jìn)行交互作用。這些交互作用在胚胎增殖、分化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮重要作用,并參與器官發(fā)育和疾病,包括各種腎臟疾病,特別是糖尿病腎病[10]。

最近,有證據(jù)表明Wnt/β連環(huán)蛋白通路在高糖條件下被激活。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn),在1型和2型糖尿病動(dòng)物模型的腎臟組織中,β-catenin和Wnt蛋白水平都是上調(diào)的。胰島素可通過降低血糖水平來減弱Wnt信號(hào)的激活。此外,高糖激活了體外培養(yǎng)的人腎近端小管上皮細(xì)胞中的Wnt信號(hào),而使用抗lrp6抗體抑制Wnt信號(hào)可改善腎臟炎癥,減少蛋白尿并改善了纖維化[11]。此外,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活已被證實(shí)在DN的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮作用,并認(rèn)為多個(gè)細(xì)胞參與了這一過程,包括系膜細(xì)胞(mesangial cells,MCs)、足細(xì)胞和管狀細(xì)胞[8-10]。

2.1Wnt/β-Catenin通路導(dǎo)致系膜細(xì)胞損傷的機(jī)制 研究表明,系膜細(xì)胞在維持腎小球的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要的作用,它能夠支持毛細(xì)血管袢并調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過率。也有證據(jù)表明,糖尿病或高血糖可誘導(dǎo)MCs凋亡,這與DN的進(jìn)展有關(guān)[12]。此外,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活也參與了DN腎小球的破壞及其機(jī)制的調(diào)控,特別是在高糖誘導(dǎo)的MCs凋亡中的作用。最近,Tung等[13]發(fā)現(xiàn)高糖可以抑制培養(yǎng)的MCs中Wnt4和Wnt5a的表達(dá),而GSK-3表達(dá)和caspase-3活性的升高會(huì)導(dǎo)致MCs凋亡水平的升高。相反,通過轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt4或Wnt5a或穩(wěn)定的β-catenin (S33Y),可以減少高糖介導(dǎo)的caspase-3斷裂和細(xì)胞凋亡,從而抑制GSK-3β激活或細(xì)胞核中β-catenin的增加。同樣,辛伐他汀通過抑制GSK-3β和恢復(fù)體內(nèi)外Wnt4和Wnt5a的表達(dá),在體外保護(hù)MCs不發(fā)生凋亡[14]。此外,螺內(nèi)酯可通過激活Wnt信號(hào)通路,顯著抑制高糖狀態(tài)下大鼠MCs的凋亡[14]。此外,高糖可誘導(dǎo)Wnt5a/β-catenin失穩(wěn),進(jìn)而促進(jìn)caspase-3和聚ADP-核糖聚合酶的裂解,導(dǎo)致培養(yǎng)的MCs凋亡[14]。這些數(shù)據(jù)表明,維持Wnt/β-catenin信號(hào)通路穩(wěn)定有利于防止高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。

研究表明,氧化應(yīng)激與Wnt/β-catenin信號(hào)在高糖環(huán)境誘導(dǎo)的MCs中存在交互作用。Tung等[13]報(bào)道高糖可誘導(dǎo)MCs中Ras和Rac1的激活,增加ROS的產(chǎn)生和Wnt5a/β-catenin的失穩(wěn),進(jìn)而通過促進(jìn)caspase 3和聚ADP-核糖聚合酶的裂解誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在轉(zhuǎn)染Ras顯性陰性(S17N)或Rac1顯性陰性(T17N)的細(xì)胞中,這種效應(yīng)被消除。此外,通過轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的β-catenin (Delta45)和激酶不活躍的GSK3β穩(wěn)定β-catenin已被證明可以減弱高糖介導(dǎo)的MCs凋亡。

眾所周知,MCs的轉(zhuǎn)變?cè)贒N的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。除了調(diào)控細(xì)胞凋亡外,越來越多的研究也表明,Wnt/β catenin參與DN條件下MCs的上皮-間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal phenotypic transition, EMT)[15]。TGF-β1被認(rèn)為是高糖誘導(dǎo)的各種細(xì)胞EMT形成的重要媒介。此外,β-catenin相互作用蛋白1 (CTNNBIP1)是miR215的直接靶點(diǎn),可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Tong等[16]發(fā)現(xiàn)miR-215表達(dá)的增加激活了Wnt/β-catenin,進(jìn)而促進(jìn)了TGF-β誘導(dǎo)的DN中MCs的EMT形成,其特征是纖維連接蛋白和β- SMA的表達(dá)增加。miR - 215的敲除可能逆轉(zhuǎn)這一表型轉(zhuǎn)變。此外,之前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)的Wnt信號(hào)可以減少c- jun依賴性TGF-β1介導(dǎo)的MCs纖維連接蛋白的積累[16],提示miR-215通過CTNNBIP1/β-catenin通路在TGF-β1介導(dǎo)的MCs、EMT形成中發(fā)揮重要作用。

近期有證據(jù)表明,CTGF/CCN家族蛋白2 (CTGF/CCN2)與Wnt信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的關(guān)系。此前的研究表明,CCN2可以通過與LRP5/6結(jié)合來調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)。此外,Wnt配體增加了非洲爪蟾胚胎中CCN蛋白的表達(dá)[17]。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)CTGF通過調(diào)控Wnt靶點(diǎn)的表達(dá),誘導(dǎo)LRP6和GSK-3β的磷酸化,導(dǎo)致β-catenin及其核定位的積累,激活轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF,增加MCs凋亡。使用內(nèi)源性LRP6受體拮抗劑DKK1或通過siRNA敲除LRP6治療可改善CCN2誘導(dǎo)的人MCs Wnt信號(hào)激活[17]。此外,SERPINA3 K(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和DKK-1都能阻斷暴露于HG的培養(yǎng)腎MCs中CTGF的過度產(chǎn)生[18]。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明,在DN條件下,Wnt信號(hào)在MCs凋亡和EMT形成中起著雙重作用。

2.2Wnt/β-Catenin通路與足細(xì)胞功能障礙的關(guān)系 新興研究表明,Wnt/CTNNBIP1在腎小球足細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞死亡和分化的調(diào)控和整合中發(fā)揮重要作用。適當(dāng)?shù)摩?catenin表達(dá)對(duì)維持腎小球?yàn)V過屏障的功能至關(guān)重要[8]。多項(xiàng)研究表明,激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)DN足細(xì)胞功能障礙[8]。足細(xì)胞損傷被認(rèn)為可誘導(dǎo)早期DN的腎小球白蛋白尿和隨后的腎小球損傷[13]。在DN患者中也觀察到足細(xì)胞中Wnt1和活性β-catenin表達(dá)的上調(diào)[13],說明Wnt/β-catenin在DN發(fā)病過程中參與足細(xì)胞損傷。然而,這一現(xiàn)象的分子機(jī)制仍然知之甚少。體外研究表明,高糖環(huán)境可通過上調(diào)TRPC6和激活典型Wnt信號(hào)通路,誘導(dǎo)分化小鼠足細(xì)胞凋亡并降低其活力,而DKK-1可阻斷典型Wnt信號(hào)通路[19]。這些結(jié)果提示,在TRPC6介導(dǎo)的DN足細(xì)胞損傷過程中,Wnt/β-catenin通路可能被激活。此外,血管緊張素II (Ang II)在促進(jìn)足細(xì)胞功能障礙和蛋白尿中發(fā)揮重要作用。令人鼓舞的是,有一些證據(jù)表明Ang II通過鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞Wnt1表達(dá)和β-catenin核易位。然而,DKK-1或β-catenin siRNA可以部分阻斷這種作用[8]。此外, Bose等[8]證實(shí)足細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在整合細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞死亡和分化過程中起著至關(guān)重要的作用。有趣的是,他們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的足細(xì)胞中CTNNB1基因的缺失增加了足細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)和足細(xì)胞活力,但細(xì)胞更容易凋亡[8]。

足細(xì)胞特異性CTNNB1敲除小鼠表現(xiàn)出基底膜損傷、蛋白尿和腎小球損傷易感性增加。重要的是,無論是足細(xì)胞特異性刪除CTNNB1還是足細(xì)胞特異性表達(dá)DKK-1的小鼠都顯示出對(duì)DN的易感性增加[20-21]。這些結(jié)果提示β-catenin是維持腎小球?yàn)V過屏障及其功能的重要調(diào)節(jié)因子。

激活的Wnt/β-catenin信號(hào)誘導(dǎo)DN足細(xì)胞功能障礙的機(jī)制是復(fù)雜的,可能涉及Wnt1或穩(wěn)定的β-catenin表達(dá)的增加,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail和抑制nephrin蛋白基因的表達(dá)。這些事件隨后導(dǎo)致足細(xì)胞功能障礙[8]。新的證據(jù)表明,足細(xì)胞在DN中經(jīng)歷EMT,這與DN的蛋白尿和腎臟纖維化相關(guān)[21]。在EMT過程中,足細(xì)胞失去了nephrin、podocin、ZO-1和p -鈣黏蛋白的表達(dá),并獲得新的標(biāo)記物,如desmin蛋白、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1 (Fsp1)、基質(zhì)金屬蛋白酶7 (MMP-7)和纖維連接蛋白。同時(shí),EMT的許多調(diào)控因子,如Wnt/β-catenin,整合素鏈接激酶(ILK)和Snail1,在足細(xì)胞中特異上調(diào)。這些體外變化表明足細(xì)胞經(jīng)歷了EMT,在體內(nèi)過表達(dá)TGF-β134的小鼠和阿霉素誘導(dǎo)的腎病小鼠中也很明顯,在蛋白尿性CKD患者的腎活檢樣本中,如局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)和糖尿病腎病中也很明顯[21],提示DN后足細(xì)胞中存在活躍的EMT形成。最近的研究也表明,ras相關(guān)的C3肉毒毒素底物1 (Rac1)及其主要下游效應(yīng)因子p21激活激酶1 (PAK1)可促進(jìn)β-catenin和Snail的轉(zhuǎn)錄活性,通過HG刺激加速足細(xì)胞EMT的形成,這可能是糖尿病足細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制[22]。

此外,Wang等[10]指出,Wnt/β-catenin通路通過激活瞬時(shí)受體電位通道6 (TRPC6)介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常調(diào)節(jié)至關(guān)重要,而DKK-1抑制Wnt/β-catenin通路可下調(diào)血糖誘導(dǎo)的TRPC6表達(dá),改善DN足細(xì)胞損傷。此外,帕立骨化醇也能改善DN的蛋白尿。研究表明,在被帕立骨化醇等激動(dòng)劑激活后,維生素D受體(VDR)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,在那里其與核β-catenin蛋白發(fā)生作用,并隔離其激活基因轉(zhuǎn)錄的能力。這一觀察結(jié)果與許多研究一致,表明VDR激活物在蛋白尿慢性腎臟病(CKD)模型中具有腎保護(hù)作用。在腎小球疾病中,VDR的激活抑制了Wnt/β連環(huán)蛋白靶基因的表達(dá),如Snail1和TRPC6,防止足細(xì)胞損傷,減少蛋白尿。因此,VDR介導(dǎo)的β-catenin的隔離可能有助于蛋白尿性CKD中維生素D類似物的腎臟保護(hù)[21]。

2.3DN腎小管細(xì)胞中Wnt/β-Catenin與EMT的關(guān)系 除損傷系膜細(xì)胞及足細(xì)胞外,新的研究表明,腎小管的損傷程度在DN的發(fā)展中也顯示出關(guān)鍵的作用[23]。腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)是DN病理的一個(gè)特征性改變,是DN合并終末期腎病的共同途徑。研究表明,腎小管上皮細(xì)胞中EMT的形成在DN腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[23]。雖然EMT發(fā)生在腎小管細(xì)胞中,并試圖避免由于暴露于各種病理生理刺激而導(dǎo)致的凋亡,但最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎功能障礙,這在DN的近端腎小管細(xì)胞(PTC)中已被在體外和體內(nèi)明顯觀察到[24]。最近,越來越多的證據(jù)表明,Wnt/β連環(huán)蛋白也有助于DN管狀細(xì)胞的EMT形成。

Zhang等[25]研究表明,高HG可增加人腎小管上皮細(xì)胞中的α-SMA和Wnt蛋白的表達(dá),并誘導(dǎo)Wnt/β-catenin激活。還有研究表明,高糖引起腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的Wnt表達(dá)增多,并且激活了Wnt/β-catenin通路 ,引起靶基因的表達(dá),包括Snail和Twist,抑制管狀細(xì)胞E-cadherin表達(dá),增加纖維連接蛋白、β-SMA和vimentin表達(dá)。

有報(bào)道在DN中,在TGF-β誘導(dǎo)的EMT形成過程中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路與TGF-β/Smad或非Smad信號(hào)通路之間存在交互作用[26]。Tian等[27]發(fā)現(xiàn),高糖增加培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞TGF-β1的分泌、改變黏附和黏附連接蛋白的表達(dá),與E-cadherin和connexin-43的產(chǎn)生有關(guān)。此外,高糖還導(dǎo)致細(xì)胞黏附屏障功能受損,細(xì)胞間通訊減少。Zeng等[28]獲得的進(jìn)一步證據(jù)表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了高血壓誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的過程,但這種作用能夠被丹參酮IIA抑制,丹參酮IIA削弱了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。研究發(fā)現(xiàn),PPARγ激動(dòng)劑曲格列酮不僅能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Akt和糖原合成酶激酶(GSK)-3b的磷酸化,還能抑制β-catenin的核易位、Smad2和Smad3的磷酸化以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的上調(diào)。這些結(jié)果表明,曲格列酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的抑制作用可能是通過抑制TGF-β1下游依賴β-catenin的信號(hào)通路,其機(jī)制不依賴于PPARC,支持TGF-β和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在EMT中相互作用。

2.4Wnt/β-catenin導(dǎo)致腎纖維化的機(jī)制 Benzing等[29]發(fā)現(xiàn),單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠Wnt/β-catenin激活與基質(zhì)金屬蛋白酶-7、纖維連接蛋白、Twist和c-Myc相關(guān)。使用重組sFRP4(一種Wnt信號(hào)的抑制劑)治療,導(dǎo)致這些細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相關(guān)基因的表達(dá)減少,并緩解了腎纖維化的進(jìn)展。另外,Wnt4蛋白在急性腎損傷動(dòng)物模型近端小管的表達(dá)明顯增加,Wnt/β-catenin的激活也參與了多囊腎的形成[30]。這些數(shù)據(jù)表明,激活的Wnt/β-catenin可能參與了各種腎損傷和腎纖維化。

3 結(jié)論

Wnt/β-catenin的持續(xù)表達(dá)對(duì)其細(xì)胞損傷保護(hù)作用至關(guān)重要,Wnt/β-catenin的異常激活會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)并促進(jìn)DN的進(jìn)展。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在DN條件下被激活,參與系膜細(xì)胞的凋亡和EMT、足細(xì)胞功能障礙和腎小管細(xì)胞EMT,隨后導(dǎo)致腎纖維化和間質(zhì)纖維化[31]。但Wnt/β-catenin的調(diào)控機(jī)制及其與DN相關(guān)的其他信號(hào)通路的交互機(jī)制非常復(fù)雜,需要進(jìn)一步研究。在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,Wnt/β-catenin信號(hào)通路靶點(diǎn)可能為預(yù)防DN進(jìn)展提供一種新的治療方法。