王 培,常志恒,柴建原,劉曉芳,馬 歡,黨 彤

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

食管癌早期臨床癥狀缺乏特異性表現(xiàn),大部分食管癌患者在疾病晚期才得到確診,以致只能選擇化療、放療的方法對(duì)腫瘤進(jìn)行控制,但放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)損傷機(jī)體的正常組織。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞存在某些特異性基因、蛋白表達(dá)的改變,這些改變可能成為腫瘤靶向治療的新靶點(diǎn)[1]。腫瘤靶向治療可以選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞,且較常規(guī)放化療造成的毒副作用更小[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)死亡受體家族很可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)之一[3],而死亡受體6(death receptor 6, DR6)作為腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor family, TNF )中死亡受體亞家族的一員,在食管中的表達(dá)及生物學(xué)功能仍不明確。細(xì)胞基質(zhì)蛋白CCN1可以增敏腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體( tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)誘導(dǎo)食管腺癌的凋亡作用[4]。本研究擬通過分析DR6、CCN1在食管癌中的表達(dá)差異及二者的關(guān)系,以期明確CCN1是否可以調(diào)控死亡受體6的表達(dá),從而為食管惡性腫瘤的治療尋找到新的生物學(xué)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人食管癌細(xì)胞株KYSE150、OE-19購(gòu)自盈灣生物技術(shù)公司,人食管上皮細(xì)胞HET-1A由首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2免疫組化蠟塊 收集2017～2020年內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院確診的食管癌患者7例,并選取患者術(shù)后食管鱗狀細(xì)胞癌及相對(duì)應(yīng)癌旁組織蠟塊,且蠟塊組織經(jīng)病理學(xué)診斷為食管惡性腫瘤及無瘤組織。實(shí)驗(yàn)中選用組織蠟塊,按照醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)管理規(guī)定,并獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)(LW-027)。

1.1.3主要試劑及耗材 RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);特級(jí)胎牛血清、胰蛋白酶(北京利維寧生物有限公司);雙抗(HyClone公司);DR6 Rabbit Polyclonal Antibody(ORIGENE公司、賽默飛公司);CCN1 Rabbit Polyclonal Antibody、DR6 primer、GAPDH primer(ORIGENE公司);辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);β-actin Mouse Monoclonal Antibody(Santa Cruz Biotechnology公司);Pierce BCA Protein Assay Kit、96孔板、Lipofectamine LTX? &PLUSTMReagent試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司);細(xì)胞裂解液、Western一抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)公司);免疫組化試劑盒、EDTA抗原修復(fù)液(福州邁新生物技術(shù)公司);Trizol試劑盒(invitrogen);GEArray Kit(SABiosciences,Frederick,USA)。

1.1.4儀器 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)、Mini-REOTEAN Tetra System、酶標(biāo)儀imark(美國(guó)伯樂);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾有限公司);金屬干浴鍋(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞株KYSE150、食管腺癌細(xì)胞株OE-19,均使用含10 %特級(jí)胎牛血清、1 %鏈霉素、青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng);食管上皮細(xì)胞HET-1A使用KBM-2培養(yǎng)基,內(nèi)含10 %特級(jí)胎牛血清,1 %鏈霉素、青霉素及多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子培養(yǎng),于5 %CO2恒溫恒濕無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,常規(guī)換液、胰蛋白酶?jìng)鞔?/p>

1.2.2免疫組織化學(xué) 使用免疫組化試劑盒,檢測(cè)同一食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌旁組織及癌腫CCN1、DR6的表達(dá)。石蠟塊-20 ℃降溫10 min,切片機(jī)蠟塊切片4 μm,烤片90 min,再快速浸入二甲苯脫蠟5 min,梯度乙醇水化,EDTA抗原修復(fù)液熱修復(fù)20 min,內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非特異性染色阻斷劑室溫孵育10 min,抗體稀釋液稀釋抗體CCN1(1 ∶200)、DR6(1 ∶100),4 ℃過夜孵育;孵育盒室溫復(fù)溫30 min,PBS沖洗3次 × 10 min,孵育二抗,鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶孵育10 min,DAB顯色、蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化,自來水返藍(lán),梯度乙醇透明,中性樹脂封片。采用PBS陰性對(duì)照。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法 食管正常上皮細(xì)胞HET-1A、食管腫瘤細(xì)胞0E-19、KYSE150,饑餓同步化后,給予刺激處理。含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白。冰面裂解30 min,4 ℃離心機(jī)15 000 r/min離心10 min;收集蛋白液,Pierce BCA Protein Assay Kit測(cè)定每組蛋白樣的濃度,配置上樣緩沖液,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,抗體稀釋液稀釋CCN1(1 ∶1 000)、DR6(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶500),4 ℃恒溫?fù)u床過夜。室溫下二抗孵育PVDF膜,TBST洗膜,配制ECL發(fā)光液并于凝膠成像儀成像。

1.2.4Real-Time RT-PCR 使用Trizol 試劑盒,參考試劑盒使用說明提取總RNA,RNeasy試劑盒純化RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總mRNA作為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄按照下列程序進(jìn)行:25 ℃/10 min-55 ℃/30 min-85 ℃/5 min-4 ℃/∞,使用對(duì)應(yīng)引物序列對(duì)DR6、GAPDH基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,完成3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析使用ΔΔCt法:ΔΔCt=(食管癌細(xì)胞株DR6基因Ct-GAPDH基因Ct)-(食管上皮細(xì)胞DR6基因Ct-GAPDH基因Ct)。最后表達(dá)量=2(-ΔΔCt).。

DR6基因引物序列:

上游引物: 5′-CCAGTGCCATTGTGGAAAAGGC-3′

下游引物: 5′-CTTCCCACTTGGGCTGCTACAA-3′

1.2.5細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,傳代至6孔板內(nèi)過夜培養(yǎng),鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好,融合度達(dá)到80 %時(shí),按照Lipofectamine? LTX &PLUSTMReagent試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。為過表達(dá)CCN1,運(yùn)用載有靶基因序列的pCMV6質(zhì)粒和其空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞OE-19、HET1A。為了敲低CCN1的表達(dá),通過采用載有特定shRNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞KYSE150。對(duì)照組細(xì)胞采用不含shRNA序列的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)。

shRNA序列:5′-GCCCTTCTACAGGCTGTTCAA-3′

2 結(jié)果

2.1食管癌中死亡受體6 mRNA的表達(dá) 與食管上皮細(xì)胞相比,食管鱗狀細(xì)胞癌、食管腺癌mRNA的表達(dá)量升高?，F(xiàn)有研究尚不清楚DR6在食管癌腫中的表達(dá)情況及其與食管上皮正常組織、細(xì)胞的差異。本研究通過RT-PCR證實(shí)食管腺癌、鱗癌中DR6表達(dá)較食管正常上皮細(xì)胞升高(表1)。這兩種不同亞型的食管腫瘤,其發(fā)病部位不同,對(duì)其基因和分子的分析顯示,食管鱗癌實(shí)際上與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌有著更多的共同特征,而食管腺癌更像胃腺癌[5],這些分子差異可能為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)。

表1 死亡受體6 mRNA在食管癌與食管正常上皮中相對(duì)表達(dá)量(fold change,n=3, P<0.05)

2.2死亡受體6(DR6)在食管鱗癌中較食管正常上皮蛋白表達(dá)量升高 如前所述,通過RT-PCR證實(shí)了DR6在mRNA轉(zhuǎn)錄層面,在食管腺癌、鱗癌細(xì)胞中較食管上皮細(xì)胞表達(dá)上升。我們通過Western Blot分析DR6的蛋白表達(dá)情況,證實(shí)相較于食管正常上皮細(xì)胞(HET-1A),DR6的表達(dá)量在食管鱗狀細(xì)胞癌(KYSE150)中升高(圖1), 其結(jié)果與RT-PCR相一致;而在食管腺癌中未發(fā)現(xiàn)明顯差異。同時(shí),7例食管鱗癌患者免疫組化結(jié)果呈現(xiàn)出癌旁組織DR6染色較癌腫染色減低的趨勢(shì),染色部位主要位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì),染色呈棕褐色(圖2),且在食管鱗癌中過表達(dá)DR6后并未發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡/壞死。這種腫瘤組織與正常組織基因表達(dá)的差異可能提示DR6表達(dá)參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展或可能是新的靶點(diǎn)。

圖1 DR6在食管上皮細(xì)胞HET-1A、食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、食管腺癌細(xì)胞OE-19中的表達(dá)情況

圖2 DR6在食管癌旁組織及食管癌中的表達(dá)情況

2.3在食管腫瘤細(xì)胞中,CCN1促進(jìn)了食管鱗癌和腺癌DR6的表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn),在食管腺癌細(xì)胞中過表達(dá)CCN1會(huì)引起細(xì)胞凋亡[4,6],這種凋亡是由于CCN1促進(jìn)了DR5(death receptor 5)的表達(dá)。我們猜測(cè),如同DR5,DR6也是死亡受體,其功能在食管癌中尚不清楚。那么,在食管腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)CCN1會(huì)引起DR6表達(dá)變化嗎?本研究首先檢測(cè)了CCN1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與食管正常上皮相比,CCN1在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中(KYSE150)中表達(dá)升高,在食管腺癌表達(dá)減低(圖3)。同樣在食管鱗癌組織免疫組化結(jié)果顯示,7例食管癌患者中癌旁組織CCN1染色程度與癌瘤組織相比減低,細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)結(jié)果相符(圖4)。

圖3 CCN1在食管上皮細(xì)胞HET-1A、食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、食管腺癌細(xì)胞OE-19中的表達(dá)情況

圖4 CCN1在食管癌旁及食管鱗癌中的表達(dá)

分析所得結(jié)果發(fā)現(xiàn),DR6和CCN1在食管癌腫中的表達(dá)呈相似的傾向。由此我們推測(cè)兩種分子存在內(nèi)部聯(lián)系。在食管腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)CCN1模型中,食管腺癌細(xì)胞株中DR6蛋白表達(dá)升高(圖5),食管鱗癌中CCN1表達(dá)升高,為此建立CCN1敲低表達(dá)模型,顯示DR6蛋白表達(dá)降低(圖6)。

圖5 食管腺癌細(xì)胞(0E-19)中CCN1對(duì)DR6的表達(dá)影響

圖6 食管鱗癌細(xì)胞(KYSE150)CCN1對(duì)DR6表達(dá)的影響

3 討論

食管癌目前仍是全世界癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一。食管癌主要有食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌兩個(gè)組織學(xué)亞型,前者發(fā)病率約占90 %。雖然食管切除術(shù)仍然是食管癌治療的主要手段,但因在早期癥狀缺乏特異性,很多患者診斷時(shí)錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī),導(dǎo)致術(shù)后仍有很高的復(fù)發(fā)率和死亡率[7]。加之術(shù)后患者的消化道正常結(jié)構(gòu)、功能的缺失,嚴(yán)重地降低了患者的生活質(zhì)量[8]。此外,部分患者失去手術(shù)機(jī)會(huì),只能選擇傳統(tǒng)的放化療,但其會(huì)損傷正常組織。在人類與癌癥的斗爭(zhēng)中,尋找一種安全、有效的治療方法至關(guān)重要。誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是可供選擇的方法之一,因?yàn)榘屑?xì)胞特異性蛋白的表達(dá)可以使凋亡具有高選擇性,對(duì)鄰近組織干擾較小,從而使生物體保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和良好的生命周期[9-10],因此尋找正常組織與病變組織特異性蛋白表達(dá)變化作為靶點(diǎn),一直是疾病研究的熱門。

死亡受體6(DR6)廣泛表達(dá)在多種組織細(xì)胞中,因含有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD),被歸為死亡受體亞家族。DR6在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的激活、凋亡和免疫反應(yīng)中起著重要作用[11]。DR6既可以通過死亡結(jié)構(gòu)(DD)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也可激活NF-κB、JNK促細(xì)胞存活[11-12]。DR6在許多腫瘤細(xì)胞系和臨床腫瘤樣本中高度表達(dá)。據(jù)報(bào)道DR6在卵巢癌、前列腺癌、成人肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高[12-14]。DR6作為一種膜蛋白,其膜外片段可被基質(zhì)金屬蛋白酶切割并釋放至胞外,可從血清中被檢測(cè)到。在對(duì)部分成人肉瘤患者血清學(xué)檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)DR6的表達(dá)較無病健康對(duì)照組患者升高,并且在評(píng)估脂肪肉瘤治療前后DR6水平,發(fā)現(xiàn)處于穩(wěn)定期的病人較進(jìn)展期病人DR6表達(dá)水平顯著下降[14]。在關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中,DR6表達(dá)水平與腫瘤分期呈正相關(guān)[13]。這些研究都在提示DR6是腫瘤潛在的分子標(biāo)志物,但在食管組織中DR6的表達(dá)尚未得到重視。本研究中,食管鱗癌細(xì)胞DR6的表達(dá),在mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯水平均較食管正常上皮細(xì)胞升高;而在食管腺癌細(xì)胞中,在mRNA轉(zhuǎn)錄水平較食管正常上皮細(xì)胞升高,而在蛋白翻譯水平蛋白表達(dá)并沒有升高,推測(cè)其可能原因與mRNA翻譯蛋白過程中調(diào)控相關(guān)。DR6在食管鱗癌中的轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)較正常上皮有上升的趨勢(shì),這種特異的蛋白分子差異,提示DR6可能是食管鱗癌潛在的診斷、預(yù)后分子標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在食管癌腫中,與正常上皮細(xì)胞相比,CCN1在食管腺癌中表達(dá)減低,在食管鱗癌中表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn),超表達(dá)CCN1可以通過調(diào)控腫瘤壞死因子相關(guān)配體(TRAIL)及DR5的表達(dá),誘導(dǎo)腺癌細(xì)胞凋亡[5-6]。同是死亡受體家族的DR6,CCN1能否影響DR6的表達(dá)和功能?為此本研究通過強(qiáng)制表達(dá)CCN1轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),證實(shí)了CCN1確實(shí)可以影響DR6的表達(dá)。且在食管兩種亞型的腫瘤細(xì)胞中證實(shí),CCN1促進(jìn)了DR6的表達(dá)。我們的研究為闡明DR6、CCN1的信號(hào)通路提供一定的參考。在另一項(xiàng)研究中證實(shí)CCN1在食管鱗狀細(xì)胞癌高表達(dá)促進(jìn)腫瘤存活并增加其侵襲性[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CCN1促進(jìn)死亡受體DR6的表達(dá),且DR6在食管鱗癌中的表達(dá)較正常細(xì)胞組織上升。分析結(jié)果后發(fā)現(xiàn)DR6在食管鱗癌中可能是利于腫瘤發(fā)展的,此結(jié)果與死亡家族特有促凋亡的生物學(xué)功能相矛盾,但正如前述,DR6因包含死亡結(jié)構(gòu)域(DD),屬于死亡受體亞家族,且DD是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要組成部分,沒有DD無法實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的功能,但這并不是絕對(duì)的,因?yàn)镈R6的死亡結(jié)構(gòu)域也是其激活NF-κB和JNK、促細(xì)胞存活所必需的。除此之外,DR6作為膜受體,目前其配體尚不明確,對(duì)闡明其功能造成很大的困擾。

本研究為一階段性總結(jié),存在著許多不足之處,如免疫組化樣本量不足(7例),未能與臨床腫瘤分期分型相結(jié)合,同時(shí)未闡明死亡受體6在食管癌中的生物學(xué)功能。后續(xù)將通過擴(kuò)大組織樣本量、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等研究方法探討死亡受體6在食管癌中的生物學(xué)功能,以及細(xì)胞基質(zhì)蛋白CCN1調(diào)控死亡受體6表達(dá)的信號(hào)通路。