賈 娜,裴漢軍

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

壓力負(fù)荷性心肌肥厚(pressure-overload myocardial hypertrophy, POMH)是在心臟后負(fù)荷長時間增加時的一種重要的代償性反應(yīng),此現(xiàn)象較常見于主動脈瓣狹窄(aortic stenosis, AS)的患者,臨床可表現(xiàn)為心絞痛、呼吸困難和暈厥[1]。中度以上AS患者一般都需進行手術(shù)治療,然而對于術(shù)后不良預(yù)后以及恢復(fù)緩慢等特點,單純解除梗阻癥狀而忽略了心肌細(xì)胞的逆重構(gòu)可能會錯失防治重度AS術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生和降低死亡率的最佳時機[2]。因此,目前亟需尋找到新的促進心肌肥厚術(shù)后逆重構(gòu)的防治策略。

遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning, RIPC)是一種在傳統(tǒng)瓣膜性心臟手術(shù)和冠脈介入術(shù)中轉(zhuǎn)化應(yīng)用最為廣泛的新型內(nèi)源性心肌保護措施[3],其通過遠(yuǎn)隔器官(相對心臟而言,如肢端)的間斷缺血/復(fù)灌數(shù)次循環(huán),可調(diào)動心臟內(nèi)源性抗損傷機制提高其對長時間缺血的耐受能力。研究表明反復(fù)多次RIPC可減輕大鼠急性心梗后不良左心室重構(gòu)[4-5]。而與RIPC具有共同保護機制的慢性運動預(yù)適應(yīng)[6-7],可減輕大鼠主動脈縮窄模型的POMH[8-10],由此推斷,RIPC對促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)具有一定的潛在作用。本文主要通過細(xì)胞層面探討RIPC在促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)中的作用及其機制,為后續(xù)研究提供相應(yīng)證據(jù)支持及研究思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用H9C2大鼠心肌細(xì)胞進行培養(yǎng)。實驗分成三組,分別為正常對照組(Sham)、POMH組、RIPC組。三組細(xì)胞培養(yǎng)方法分別為:正常對照組無其他干預(yù)常規(guī)DMEM培養(yǎng)5 d;POMH組通過Ang II處理24 h后,常規(guī)DMEM液培養(yǎng)4 d;RIPC組通過Ang II處理24 h后對細(xì)胞用RIPC分離液稀釋處理1 h(1次/24 h,共4次)。

1.2檢測指標(biāo) 通過檢測細(xì)胞內(nèi)腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)兩種心肌肥厚標(biāo)志物的表達(dá),判斷H9C2心肌肥厚細(xì)胞模型建立成功與否以及RIPC對其是否具有逆轉(zhuǎn)作用;檢測細(xì)胞凋亡標(biāo)志物程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death factor 4,PDCD4)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和線粒體自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II/I和Beclin1。

1.3實時定量PCR檢測法 采用Trizol法提取各組H9C2細(xì)胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,用實時定量PCR檢測BNP、β-MHC表達(dá)水平。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃變性30 s,隨后94 ℃退火30 s和60 ℃延伸30 s共40～50次循環(huán)。所有目的基因mRNA定量結(jié)果均通過熔解曲線分析驗證PCR產(chǎn)物的特異性,確保產(chǎn)物無引物二聚體,每樣本重復(fù)3次。用2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達(dá)水平。基因序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4Western blot蛋白免疫印跡法 通過試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白,按照BCA試劑盒說明書進行蛋白定量后,每個樣孔加入30 μg蛋白樣品進行Western blot檢測,以β肌動蛋白作為內(nèi)參,采用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance,IA)值進行分析。待測蛋白相對表達(dá)水平用(目標(biāo)蛋白/β肌動蛋白)表示。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖,用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析數(shù)據(jù),組間比較方差齊用LSD檢驗,方差不齊采用Dunnett T3檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RIPC對POMH逆重構(gòu)的改善作用 通過PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)心肌肥厚標(biāo)志物β-MHC和BNP的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與正常組相比,POMH組內(nèi)β-MHC和BNP的表達(dá)含量升高(P<0.05),在給予RIPC處理后能夠明顯降低β-MHC和BNP的表達(dá)水平,從而改善POMH中心肌細(xì)胞功能障礙。見圖1。

圖1 RIPC對POMH術(shù)后逆重構(gòu)的改善作用

2.2RIPC促進POMH逆重構(gòu)作用機制探索 為了進一步探索RIPC促進POMH逆重構(gòu)的作用機制,通過Western blot蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白以及線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與正常組相比,POMH組中PDCD4和Cleaved-caspase-3相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),給予RIPC處理后能夠明顯抑制該細(xì)胞凋亡趨勢;在自噬水平上,RIPC亦能夠通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)LC3II/I以及Beclin1蛋白表達(dá)水平從而達(dá)到促進POMH中逆重構(gòu)的作用。見圖2、3。

圖2 RIPC改善POMH中細(xì)胞凋亡

圖3 RIPC通過線粒體自噬促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)

3 討論

壓力負(fù)荷性心肌肥厚是一種重要的代償性反應(yīng),其作用是減少室壁承受的壓力及維持正常心輸出量,在細(xì)胞水平表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、新肌小節(jié)蛋白形成。然而,心肌細(xì)胞肥大,細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目卻增加不明顯,同時單位心肌重量的毛細(xì)血管相對減少,發(fā)生“心肌肥大不平衡生長”現(xiàn)象,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙[11]。研究表明,心肌肥厚可造成心肌細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)失衡。線粒體作為細(xì)胞能量代謝的樞紐,提供細(xì)胞維持生命活動所需要的必要物質(zhì),有“細(xì)胞動力工廠”之稱[12]。線粒體自噬是一種特異性細(xì)胞器自噬,適度自噬可選擇性清除受損的線粒體,避免細(xì)胞死亡;過度自噬則會損傷正常的線粒體[13]。線粒體自噬與心肌細(xì)胞功能障礙的相關(guān)性是RIPC促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)作用機制的研究重點。

本研究對RIPC促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)的作用及機制進行探索,通過H9C2心肌細(xì)胞建立模型。腦鈉肽主要是從胚胎和成體的心肌細(xì)胞中產(chǎn)生,在病理條件下,經(jīng)過促肥大因子的影響,心室肌細(xì)胞從收縮(成人)到合成體(胚胎),作為心肌收縮的一種重要補償機制,BNP基因會再次表達(dá)[14]。目前研究已發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志物有β-肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1/3(MLC1/3)、肌鈣蛋白C、腦鈉肽等[15-16],故本次研究通過檢測細(xì)胞內(nèi)β-MHC和BNP兩種心肌肥厚標(biāo)志物的表達(dá),判斷H9C2心肌肥厚細(xì)胞模型建立成功與否以及RIPC對其是否具有逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果顯示,給予RIPC處理后能夠明顯逆轉(zhuǎn)心肌肥厚相關(guān)蛋白β-MHC和BNP的表達(dá)水平,表明RIPC對于促進心肌細(xì)胞POMH逆重構(gòu)具有較好作用。PDCD4和Caspase-3廣泛存在于各種凋亡細(xì)胞中,并且在心肌細(xì)胞也有表達(dá),是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子之一[17]。LC3-I通過復(fù)合物的作用與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合,生成LC3-II;隨后LC3-II與吞噬團和自噬體膜緊密結(jié)合,是典型線粒體自噬完成的經(jīng)典標(biāo)志物,因此LC3-II蛋白被廣泛用作自噬指標(biāo)[17-18]。同樣,作為非典型自噬標(biāo)志物的Beclin1蛋白能夠跟III類磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K)結(jié)合從而參與線粒體非典型自噬過程[19]。結(jié)果顯示,給予RIPC處理后能夠通過下調(diào)PDCD4和Caspase-3的表達(dá)水平,明顯抑制POMH組中細(xì)胞凋亡率的增加,并且通過線粒體自噬途徑上調(diào)LC3II/I和Beclin1的蛋白表達(dá)水平,達(dá)到促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)的作用,顯示其作用機制與線粒體自噬相關(guān)。

綜上所述,RIPC能夠促進POMH術(shù)后逆重構(gòu),其機制與線粒體自噬相關(guān),本次研究為RIPC促進POMH術(shù)后逆重構(gòu)作用提供新的研究思路,具體機制有待進一步研究。