董文杰,閻小霞,賈彥彬,解英波,高 芳

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭市疾病預(yù)防控制中心)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球性的公共衛(wèi)生問題,估計(jì)全球HBV攜帶者高達(dá)3.7億人[1]。我國是乙型肝炎的高發(fā)流行區(qū)。2016年全國HBV感染血清流行病學(xué)調(diào)查研究,整體人群乙肝病毒表面抗原(HBsAg)攜帶率為10 %[2],約占全球HBV攜帶者三分之一[3]。HBV感染后臨床表現(xiàn)呈多樣性,可表現(xiàn)為慢性乙型肝炎(chronic Hepatitis B,CHB)、急性肝炎、重癥肝炎或無癥狀攜帶者[4]。機(jī)體內(nèi)乙型肝炎病毒的持續(xù)感染可以引起慢性肝臟疾病,主要臨床轉(zhuǎn)歸有肝硬化和肝癌[5]。目前仍缺乏高效藥物用于乙型肝炎治療[4],如何對(duì)乙型肝炎進(jìn)行有效防治,是目前面臨的一個(gè)公共衛(wèi)生問題。探索影響乙型肝炎病毒感染的因素并有效地控制HBV感染是亟待解決的問題。

近年來,Toll樣受體家族(toll-like receptors, TLRs)是一類跨膜信號(hào)傳遞受體,屬于模式識(shí)別受體,在抗病原微生物與抗感染免疫防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[6]。TLRs在肝臟組織細(xì)胞中均有表達(dá),并使其在非特異性免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生和釋放多種細(xì)胞因子與炎癥因子,參與肝細(xì)胞免疫病理損傷[7]。到目前為止,人體已發(fā)現(xiàn)11種TLRs[7],其中TLR3 (toll-like receptor 3,TLR3)能夠特異性識(shí)別病毒dsRNA,表達(dá)于Kupffer細(xì)胞、肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞,發(fā)揮抗病毒感染的作用[8]。研究表明TLR3的異常表達(dá)與HBV相關(guān)性肝癌有一定關(guān)系[9]。本研究選取內(nèi)蒙古鄂爾多斯市漢族人群,探討TLR3基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎病毒感染易感性的相關(guān)性,為HBV相關(guān)的慢性乙型肝炎的早期診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2014年5月至2016年7月鄂爾多斯第二人民醫(yī)院收治的172例慢性乙型肝炎患者為CHB組。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)乙肝表面抗原(HBsAg)、表面抗體(抗HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、e抗體(抗HBe)、乙肝核心抗體(抗HBC)5項(xiàng)血清標(biāo)記物檢查結(jié)果進(jìn)行診斷,以HBsAg陽性且乙肝病毒感染時(shí)間超過半年為CHB。同時(shí)收集門診體檢健康者200例為正常對(duì)照組(乙肝血清五項(xiàng)標(biāo)志物結(jié)果全部為陰性,均無乙肝的病史和明顯的肝部疾病)。CHB病例組和對(duì)照組均為內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)漢族人,相互之間無血緣關(guān)系。

1.2基因分型 (1)基因組DNA提取:無菌抽取血樣3 mL,應(yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血中的DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進(jìn)行基因分型。①SNP rs3775290位點(diǎn)引物序列:上游引物為5′-ATGTTGGCTATGTTGTTGTTGC-3′,下游5′-CAAAGTATTTCCCTTGCCTCCAC-3′。②PCR反應(yīng)體系:擴(kuò)增總體系為25 μL, 內(nèi)含基因組DNA (60 ng/μL、2 μL),2×Taq Master Mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL(10 μmol/L), ddH2O 8.5 μL。③PCR擴(kuò)增:rs3775290位點(diǎn)反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min后,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)中94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物長度為557 bp,1.5 %瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析PCR產(chǎn)物的特異性。④RFLP的反應(yīng)體系:總體系20 μL,包含限制性內(nèi)切酶BstBI(0.5 μL)、PCR產(chǎn)物(2 μL)、10×Buffer(2 μL),ddH2O(15.5 μL)。在37 ℃水浴60 min。rs3775290位點(diǎn)酶切后得到一條557 bp的基因片段為AA純合子;得到373 bp、184 bp的基因片段為GG純合子,得到557 bp、373 bp、184 bp 3種大小不同的基因片段為AG雜合子。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)檢測基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;先檢測等位基因和基因型在CHB病例組和對(duì)照組的頻率分布差異,用非條件性Logistic回歸計(jì)算比值(OR)及其95 %可信區(qū)間(CI)評(píng)價(jià)等位基因、基因型與慢性乙型肝炎發(fā)生的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般資料 在372例樣本中,CHB組172例,對(duì)照組200例,兩組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CHB病例組和正常對(duì)照組的一般特征

應(yīng)用Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)方法,CHB病例組χ2=2.11,P=0.34 ;正常對(duì)照組χ2=0.304,P=0.859,均P>0.05,說明TLR3 rs3775290 位點(diǎn)在對(duì)照組和CHB組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡, 提示本研究樣本具有群體代表性。

2.2TLR3 基因SNP rs3775290位點(diǎn)等位基因、基因型與慢性乙型肝炎病毒感染的關(guān)聯(lián)分析 SNP rs3775290位點(diǎn)在對(duì)照組中GG、AG 、AG基因型頻率分別為50.5 %、39.5 %、10.0 %。在CHB病例組GG、AG、AA基因型頻率分別為56.4 %、34.9 %、8.7 %。在對(duì)照組中等位基因G、A頻率分別為70.2 %、29.8 %。在CHB病例組等位基因G、A頻率分別為73.8 %、26.2 %。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:TLR3基因SNP rs3775290位點(diǎn)其基因型頻率、等位基因頻率在CHB組和對(duì)照組的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 rs3775290位點(diǎn)基因型、等位基因與慢性乙型肝炎病毒感染的關(guān)聯(lián)分析

2.3不同遺傳模式下rs3775290與慢性乙型肝炎病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 分析TLR3基因SNP rs3775290在共顯性、顯性、隱性、超顯性等四種遺傳模型下與慢性乙型肝炎病毒感染的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,在四種遺傳模型下,SNP rs3775290與HBV感染均無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表3。

表3 不同遺傳模式下 rs3775290與慢性乙型肝炎病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

3 討論

乙型肝炎病毒感染后臨床表現(xiàn)呈多樣性,可表現(xiàn)為慢性乙型肝炎、急性肝炎、重癥肝炎、無癥狀攜帶者[4]。1963年,Blumberg在研究人類血清蛋白的多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)HBV的表面抗原[2]。肝細(xì)胞雖然是HBV的靶細(xì)胞,但近年來大量的研究表明,HBV并不直接引起肝細(xì)胞損傷,而是通過血液或肝細(xì)胞膜上的病毒抗原成分誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。研究表明,當(dāng)乙型肝炎病毒感染者免疫力處于較低水平時(shí),病毒與宿主之間和平共處形成免疫耐受,臨床表現(xiàn)為無癥狀HBV攜帶者或慢性持續(xù)性肝炎[4]。慢性肝炎造成的肝細(xì)胞慢性病變誘發(fā)肝硬化。目前仍缺乏特效的藥物用于乙型肝炎治療,一般認(rèn)為,同時(shí)應(yīng)用廣譜抗病毒藥物和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥物治療效果較好。干擾素、拉米夫啶、IFN-α及清熱解毒、活血化瘀的中草藥等,對(duì)部分病例有一定療效。因此,針對(duì)慢性乙型肝炎病毒的人群遺傳基因型以及抗感染免疫防御機(jī)制研究尤為重要。

Toll樣受體家族(TLRs)在抗病原微生物與抗感染免疫防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[6]。到目前為止,人體已發(fā)現(xiàn)11種TLRs[7]。其中TLR3 (toll-like receptor3,TLR3)能夠特異性識(shí)別病毒dsRNA,表達(dá)于Kupffer細(xì)胞、肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞,在微生物感染中也發(fā)揮一定的免疫防御作用。TLR3是病毒dsRNA的受體。當(dāng)病原體感染宿主時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一些病毒相關(guān)模式識(shí)別分子,這些分子可以與機(jī)體的模式識(shí)別受體(TLR3 就是模式識(shí)別受體之一)發(fā)生特異性結(jié)合,從而激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,發(fā)揮抗病毒感染作用[10]。王紅梅等[11]對(duì)TLR3在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)患者的TLR3的表達(dá)水平高于健康對(duì)照人群。國外文獻(xiàn)也做了相關(guān)的研究報(bào)道,如AL-Qahtani等[12]研究了沙特阿拉伯人群中TLR3基因rs5743311等9個(gè)位點(diǎn)的SNP與HBV發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性[9]。

本研究在內(nèi)蒙古鄂爾多斯市漢族人群中檢測了TLR3基因rs3775290位點(diǎn)多態(tài)性與慢性乙型肝炎病毒的感染關(guān)系。研究樣本為內(nèi)蒙古鄂爾多斯市漢族人群。SNP rs3775290位點(diǎn)在CHB病例組GG、AG、AA基因型頻率分別為56.4 %、34.9 %、8.7 %;等位基因G、A頻率分別為73.8 %、26.2 %。對(duì)照組中GG、AG 、AG基因型頻率分別為50.5 %、39.5 %、10.0 %;等位基因G頻率為70.2 %、A頻率為29.8 %。研究表明在內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)漢族人群中慢性HBV感染者rs3775290位點(diǎn)GG基因型頻率最高,AA基因型頻率最低,等位基因G頻率遠(yuǎn)高于A基因頻率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,TLR3 基因SNP rs3775290位點(diǎn),兩組基因型頻率分布差異P=1.531、等位基因頻率的分布差異P=1.397,兩組均P>0.05,說明rs3775290位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率在CHB病例組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs3775290位點(diǎn)在共顯性、顯性、隱性、超顯性四種遺傳模型下均與慢性HBV感染風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05),提示rs3775290在內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)漢族人群慢性HBV感染中不起主要作用。

本研究結(jié)果與黃霞梅等[9]研究結(jié)果不太一致,他們認(rèn)為TLR3 基因rs3775290位點(diǎn)AA基因型可能是乙肝病毒相關(guān)性肝臟疾病的保護(hù)因素[9]。結(jié)果不太一致可能原因:①研究樣本中人群所處的地理位置不同,生活環(huán)境不同。本研究樣本來自中國北方鄂爾多斯地區(qū)漢族人群,而他們樣本均來自中國南方的廣西地區(qū)人群。②地理環(huán)境不同,HBV的基因型不同而有差異。HBV基因組全序列的差異大約等于8 %,可將HBV分為A ～ J 10個(gè)基因型,各基因型又可分為多個(gè)不同的亞型。不同地區(qū)流行的基因型不同,A型主要見于美洲和西歐,D型見于中東、北非和南歐,E型見于非洲,我國及亞洲其他地區(qū)流行的主要是B型和C型。我國北方以C型為主,南方以B型為主,偶爾有A型和D型的報(bào)道[2]。③兩項(xiàng)研究CHB病例組的選擇標(biāo)準(zhǔn)有差異。本研究選擇乙肝血清學(xué)免疫指標(biāo)均為HBsAg陽性患者,而黃霞梅團(tuán)隊(duì)的研究CHB病例組選擇HBV-DNA檢測陽性,血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)或反復(fù)升高的患者。④本研究樣本偏少,還需擴(kuò)大樣本量深入研究,并且課題組正在繼續(xù)研究TLR3基因的另外兩個(gè)位點(diǎn)rs1879026、 rs5743309與慢性HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系。