徐益平，尚韜

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，CRC發(fā)病率在所有腫瘤中位居第三，死亡率僅次于肺癌位居第二[1]。遠處侵襲和轉(zhuǎn)移是CRC相關(guān)死亡發(fā)生的重要原因之一，盡管CRC治療手段不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效和預(yù)后仍不理想[2-3]。因此，開發(fā)新的分子診療手段，防治結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，對于提高結(jié)直腸癌患者長期生存和改善預(yù)后意義重大。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）指上皮細胞獲得間充質(zhì)表型的細胞重編程過程，在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移侵襲過程中發(fā)揮重要作用[3]。LIM和SH3蛋白1（LASP1）是CRC發(fā)展過程中一種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，可通過介導(dǎo)EMT、誘導(dǎo)癌細胞侵襲性表型影響結(jié)直腸癌進展[4]。粘附斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）/蛋白激酶B（AKT）可介導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞EMT促進細胞遷移、侵襲能力[5]。研究報道LASP1可通過誘導(dǎo)FAK/AKT信號通路促進非小肺細胞癌的增殖和侵襲能力[6]。LASP1能否通過FAK/AKT信號通路促進結(jié)直腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移還未明確。本研究擬通過體外實驗探究LASP1介導(dǎo)FAK/AKT在結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移侵襲中的作用，以期完善CRC轉(zhuǎn)移的作用機制，為其防治帶來新辦法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LOVO人結(jié)腸癌細胞（賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，iCell-h126）；pCMV6-ddk-myc、pCMV6-ddk-myc-LASP1、LASP1-siRNA、NC-siRNA（上海吉瑪公司合成提供）；Lipofectamine 3000 試劑（美國Invitrogen抗體公司，L3000-008）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone試劑公司， SH30243.01）；Transwell小室、Basement Membrane Matrix基質(zhì)膠（美國康寧試劑公司， 3422、356234）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技公司， pc0020）；FAK、p-FAK、AKT、p-AKT蛋白抗體（美國Affinity抗體公司，AF6397、AF3398、AF6261、AF0016）；LASP1蛋白抗體（美國Abcam抗體公司，ab117806）；RIPA裂解液、Tunel細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物公司，P0013D、C1090）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（江蘇康為世紀生物公司，CW2569）；MTT試劑盒、總RNA提取試劑TRIzol（生工生物工程（上海）公司，E606334-0500、B511311）。

1.2 實驗儀器

BB150細胞培養(yǎng)箱、Micro17R低溫高速離心機（美國Thermo公司）；610020-9Q化學(xué)發(fā)光儀（中國上海勤翔儀器公司）；CMaxPlus酶標儀（美國MD公司）；CFX Connect實時熒光定量PCR儀（美國BIO RAD公司）。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

LOVO細胞使用含10%胎牛血清、1%的青霉素改良的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 3000試劑將pCMV6-ddk-myc（空白質(zhì)粒）、pCMV6-ddk-myc-LASP1（LASP1過表達質(zhì)粒）、NC-siRNA（sc-37007）（空白沉默質(zhì)粒）、LASP1-siRNA（sc-105607）（LASP1沉默質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染至LOVO細胞，并根據(jù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒進行相應(yīng)分組，分別為pCMV6-NC組、pCMV6-LASP1組、NC-siRNA組、LASP1-siRNA組。

1.4 qRT-PCR檢測LASP1基因表達

提取各組細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR進行DNA擴增，實時熒光定量PCR檢測LASP1表達。反應(yīng)條件為變性95℃ 10 min，擴增反應(yīng)，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40次，溶解曲線，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。采用2-△△CT法對結(jié)果進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 MTT實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于平板。每孔加入10 μl MTT溶液與細胞混合，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后取出。酶標儀測定490 nm處吸光度值，進行細胞存活計算。

1.6 Tunel染色

平板接種細胞后用4%多聚甲醛通透細胞。每平板細胞中加入50 μl Tunel檢測液，室溫下避光孵育1 h。PBS漂洗三次，制片、封片。熒光顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)Tunel陽性細胞數(shù)量。

1.7 Transwell實驗

Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板，細胞加入上層小室，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后，棉簽擦掉上室底層細胞。4%多聚甲醛固定下層小室細胞10 min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染液染色計數(shù)遷移至下室中的細胞數(shù)量。30 μl Matrigel稀釋液包被Transwell小室后4℃孵育過夜，上室加入細胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棉簽擦掉上室底層細胞和剩余Matrigel稀釋液，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染液染色計數(shù)侵襲至下室中的細胞數(shù)量。

1.8 劃痕實驗

各組細胞接種于平板，200 μl移液器吸頭劃線創(chuàng)建傷痕，分別24、48 h觀察劃線內(nèi)細胞愈合情況，并拍照計數(shù)。

1.9 Western blot實驗

RIPA裂解收集細胞，離心收集底部細胞沉淀。BCA法測定細胞總蛋白濃度，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉孵育，TBST清洗。加入檢測的稀釋后的FAK、p-FAK、AKT、p-AKT、LASP1一抗抗體，4℃下?lián)u床振蕩孵育過夜。隔天室溫下振蕩30 min，將上層液體輕輕吸出，TBST清洗3遍。5%脫脂奶粉封閉液稀釋，稀釋對應(yīng)二抗抗體振蕩孵育1.5 h，TBST清洗。ECL化學(xué)發(fā)光顯影，計算各蛋白相對表達含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。所有數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染結(jié)果鑒定

與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組細胞LASP1mRNA表達顯著上升（P=0.002）。與NCsiRNA組比較，LASP1-siRNA組細胞LASP1mRNA表達顯著下降（P=0.001），見表2。結(jié)果顯示細胞轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實驗檢測。

表2 qRT-PCR檢測LOVO細胞轉(zhuǎn)染后LASP1的表達Table 2 LASP1 mRNA expression in transfected LOVO cells detected by qRT-PCR

2.2 LASP1對LOVO細胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組的細胞存活率顯著上升（P=0.000），與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組的細胞存活率顯著下降（P=0.000），見表3。

表3 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞存活的影響Table 3 Effects of overexpression or silencing of LASP1 on the survival of LOVO cells

2.3 LASP1對LOVO細胞遷移侵襲的影響

Transwell和劃痕實驗結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組細胞的遷移以及侵襲數(shù)量顯著上升（分別P=0.003、P=0.000），24和48 h傷口愈合率均顯著升高（分別P=0.004、P=0.009）；與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組細胞的遷移以及侵襲數(shù)量顯著下降（分別P=0.002、P=0.001）、24 h和48 h傷口愈合率均顯著降低（P=0.006、P=0.004），見圖1。

圖1 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞遷移及侵襲能力的影響Figure 1 Effects of LASP1 overexpression or silence on migration and invasion of LOVO cells

2.4 LASP1對LOVO細胞凋亡的影響

Tunel染色結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCM V 6-L A S P 1 組細胞凋亡率顯著降低（P=0.003）；與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組細胞凋亡率顯著升高（P=0.000），見圖2。

圖2 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞凋亡的影響 (Tunel染色)Figure 2 Effects of LASP1 overexpression or silence on apoptosis of LOVO Cells (Tunel staining)

2.5 LASP1對LOVO細胞LASP1、FAK/AKT通路蛋白表達的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組細胞LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表達顯著上升（分別P=0.002、P=0.010、P=0.004）；與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組細胞LASP1、p-FAK/FAT、p-AKT/AKT蛋白表達顯著下降（分別P=0.000、P=0.005、P=0.002），見圖3。

圖3 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞相關(guān)蛋白表達的影響Figure 3 Effects of LASP1 overexpression or silence on related protein expression in LOVO cells

3 討論

LASP1基因位于染色體17q11-21.3，屬于大肌動蛋白結(jié)合神經(jīng)蛋白家族成員，在人體大部分組織內(nèi)低表達[7-8]。LASP1的兩端為LIM和SH3結(jié)構(gòu)區(qū)域，可分別與肌動蛋白和其他信號受體發(fā)生作用，參與細胞運動、侵襲等過程[8]。LASP1在晚期結(jié)直腸癌組織中表達顯著高于早期，可介導(dǎo)EMT促進CRC遷移，而敲除LASP1表達可以抑制CRC的轉(zhuǎn)移侵襲[9]。而在體模型表明，LASP1過表達促進了小鼠結(jié)直腸原位腫瘤生長和進展[10]。本研究通過構(gòu)建LASP1過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌LOVO細胞，通過細胞功能實驗檢測LASP1不同表達對LOVO細胞的影響，結(jié)果與朱龍海等[11]研究相符，表明LASP1基因的表達與結(jié)腸癌細胞遷移侵襲相關(guān)。

FAK為促轉(zhuǎn)移功能蛋白，磷酸化表達增加可促進CRC細胞EMT及遷移和侵襲能力[12-13]。研究表明，F(xiàn)AK表達降低可抑制CRC細胞與胞外基質(zhì)粘連作用，進而抑制CRC細胞遷移[14]。AKT相關(guān)通路為調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和抗凋亡的重要通路，結(jié)直腸癌出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜層浸潤以及腫瘤低分化患者其癌組織p-AKT表達顯著升高，p-AKT表達與CRC發(fā)展、預(yù)后相關(guān)[15]。Xu等研究表明FAK蛋白與AKT蛋白可相互作用，敲減CRC細胞FAK表達可抑制p-AKT表達，從而抑制CRC細胞干細胞樣特性與轉(zhuǎn)移能力[16]。其他相關(guān)研究表明，F(xiàn)AK/AKT信號通路激活，可增強CRC細胞遷移、侵襲能力和EMT[5,17]。Zhou等研究結(jié)果表明LASP1可通過激活A(yù)KT促進CRC進展[18]。本研究結(jié)果表明，LASP1可調(diào)控CRC細胞中FAK/AKT信號通路的表達，由此推測LASP1可介導(dǎo)FAK/AKT信號通路參與CRC細胞增殖、遷移及侵襲過程。

綜上，本研究結(jié)果表明LASP1基因表達促進了LOVO細胞增殖、遷移和侵襲能，而敲減LOVO細胞LASP1表達起相反作用，LASP1介導(dǎo)FAK/AKT通路表達是其促進CRC發(fā)展機制之一。由于本課題組條件有限，未能進行動物模型實驗進一步研究LASP1介導(dǎo)FAK/AKT表達對CRC進展的影響。以后我們將繼續(xù)探索LASP1介導(dǎo)FAK/AKT調(diào)控CRC進展的機制，為臨床防治CRC轉(zhuǎn)移提供新的方向。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。