邵 帥,石學(xué)穎,王 洋,丁 濤,姜經(jīng)航,江 梅

0 引 言

精子冷凍技術(shù)作為輔助生殖技術(shù)中的重要組成部分,廣泛應(yīng)用于供精的保存、自體精子保存以及放化療前生育力保護。玻璃化冷凍是將細胞中的水分置換成高濃度的冷凍保護劑,在冷凍過程中形成玻璃化狀態(tài),保存了細胞中的正常分子和離子分布,避免細胞內(nèi)冰晶的形成,從而達到保護精子細胞的目的[1]。由于微量精子像嚴重少精癥精子、睪丸穿刺和附睪穿刺精子不易獲取,質(zhì)量也差,精子的特殊結(jié)構(gòu),其內(nèi)部水分含量很低,常規(guī)冷凍方法不適用于精子冷凍;此方法使用高濃度滲透性保護劑具有很強的細胞毒性,能對細胞產(chǎn)生化學(xué)損傷,導(dǎo)致精子化學(xué)結(jié)構(gòu)改變和能量代謝紊亂[2-3]。

為了避免高滲透性冷凍保護劑對精子的毒性影響,近年來研究發(fā)現(xiàn)無滲透性冷凍保護劑玻璃化冷凍精子開始應(yīng)用,通過加入終濃度為0.25 mol/L 蔗糖玻璃化冷凍精子的方法,避免了滲透性冷凍保護劑的使用,與常規(guī)冷凍相比,有更高的回收率、活力以及更低的DNA碎片[4]。盡管在精子冷凍領(lǐng)域取得了長足的進展,但精子解凍后的活力和受精率顯著下降,這在一定程度上是由于低溫保存誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,從而形成活性氧(ROS),精子質(zhì)膜的多不飽和脂肪酸易受ROS損傷,導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)和功能受損。因此,尋找合適的抗氧化劑減少自由基和氧化應(yīng)激,從而提高輔助生殖技術(shù)的生育潛力勢在必行。本研究通過在微量精液中加入褪黑素,觀察對無滲透性冷凍保護劑的精子玻璃化冷凍影響研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2022 年4-9月在荊門市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的30例男性患者的精液樣本?；颊呓?～7 d后手淫取精,精液取出置于 37 ℃孵箱,完全液化后檢查,正常精液先進行梯度離心(SAGE),然后加精子培養(yǎng)液(COOK)進行洗滌,最后加精子培養(yǎng)液進行上游,將上游后的精子密度調(diào)至( 1-5) × 106/mL待用。納入標準:①年齡20～55歲;②世界衛(wèi)生組織 (WHO)《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版正常值(精子濃度≥15×106/mL,前向運動精子(PR)≥32%,PR+非前向運動精子≥40%,pH≥7.2,液化時間<60 min)、正常形態(tài)≥4%。排除標準:精液量<1 mL。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過(批準號:2022051215),患者知情同意,所有精液樣本處理后按醫(yī)療廢物處理。

1.2 方法

1.2.1 精子冷凍分組上游處理后每份精子分為4組,常規(guī)冷凍組:精子懸液中逐滴加入等體積的精子冷凍保護劑(Quinns Advantage Sperm Freezing Me-dium, SAGE),取60 μL加入 2 mL 的冷凍管中,然后置于液氮面上方 15 cm 熏蒸 30 min,投入液氮保存;微滴冷凍組:將精子懸液與等體積精子冷凍保護劑混合后共計60 μL,用拉細巴斯德吸管吸取精子混合液于管口形成10～15 μL液滴后即滴入液氮中,形成致密微滴后沉入液氮底部,將其裝入冷凍管后置于液氮中保存;無保護劑微滴冷凍組:將精子懸液加入等體積 0.5 mol/L蔗糖溶液共計60 μL,混合液中蔗糖終濃度為 0.25 mol/L,用拉細巴斯德吸管吸取精子混合液于管口形成10～15 μL液滴后即滴入液氮中,將其裝入冷凍麥管后置于液氮中保存;褪黑素+無保護劑微滴冷凍組:將精子懸液加入等體積 0.5 mol/L蔗糖溶液共計60 μL,混合液中加入褪黑素使其終濃度為0.01 mmol/L。用拉細巴斯德吸管吸取精子混合液于管口形成10～15 μL液滴后即滴入液氮中,形成致密微滴后便沉入液氮底部,將其裝入冷凍麥管后置于液氮中保存。

1.2.2 精子復(fù)蘇精子液氮凍存 24 h 后取出,常規(guī)冷凍立即將凍存管置于 37 ℃ 恒溫水浴箱中振蕩混勻直至完全液化,300g離心10 min留底部沉淀100 μL;微滴組將凍存管內(nèi)的冷凍微滴投入 37 ℃孵育的 3 mL精子培養(yǎng)液中,直至微滴全部溶解。300 g離心10 min留底部沉淀100 μL。計算機輔助精液分析法(CASA)檢測精子活力,計算精子復(fù)蘇率。

1.2.3 精子存活情況應(yīng)用伊紅-苯胺黑染色試劑盒測定存活精子百分率,分別取20 μL復(fù)蘇后精液與20 μL染色劑在室溫下混合,染色 30 s后,取20 μL精液涂片,干燥封片。計數(shù) 200個精子,頭部未染色的為活精子,而頭部染紅為死精子,計算存活精子百分率。

1.2.4 精子形態(tài)情況采用改良巴氏染色法,對精子頭部、頸部、尾部形態(tài)進行評判,計算正常形態(tài)精子。

1.2.5 質(zhì)膜完整性檢測采用低滲腫脹試驗檢測精子質(zhì)膜完整性。取20 μL精液加入到200 μL低滲試劑(含有果糖和檸檬酸)中, 37 ℃水浴中平衡30 min,取15 μL涂片,用光學(xué)顯微鏡觀察觀察彎尾的精子數(shù)。

1.2.6 頂體完整性采用改良巴氏染色法,Ⅰ型:頂體完整,頂體邊緣整齊,有時可見清晰的赤道板;Ⅱ型:頂體輕微膨脹,頂體膜疏松膨大;Ⅲ型:頂體破壞,精子質(zhì)膜嚴重受損,邊緣不整齊;Ⅳ型:頂體全部脫落,核裸露。Ⅰ型是頂體正常的精子,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型均為頂體不完整。計算頂體完整率。

1.2.7 DFI檢測DFI檢測采用精子DNA碎片檢測試劑盒 (深圳博銳德) , 按試劑盒說明書步驟操作,100倍油鏡下觀察, 比較精子核和核周圍暈輪大小, 評價精子DNA碎片率。根據(jù)單側(cè)暈輪厚度與精子頭部最小直徑比例進行評判, 當單側(cè)暈輪厚度≤1/3精子頭部最小直徑時,表明精子存在DNA碎片。精子DNA碎片率>25%視為異常。

1.2.8 MDA、SOD和GSH-Px檢測采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定,按照說明書操作,各管分別加入精子懸液以及相應(yīng)的試劑,酶標儀測定測各管吸光度值,通過公式計算含量。

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素對復(fù)蘇后精子活力、復(fù)蘇率以及存活率的影響CASA和伊紅-苯胺黑染色結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后PR和存活率均低于冷凍前(P<0.01);微滴冷凍組、無保護劑微滴冷凍組復(fù)蘇后PR、復(fù)蘇率及復(fù)蘇后存活率高于常規(guī)冷凍組(P<0.05);無保護劑微滴冷凍組復(fù)蘇后精子存活率明顯高于微滴冷凍組(P<0.05);褪黑素+無保護劑微滴冷凍組復(fù)蘇后PR和復(fù)蘇率高于無保護劑微滴冷凍組(P<0.05)。見表1。

表1 褪黑素對精子復(fù)蘇后活力、復(fù)蘇率以及存活率的影響Table 1 Effects of melatonin on sperm motility, resuscitation rate and survival rate after

2.2 褪黑素對精子復(fù)蘇后正常形態(tài)率和頂體完整性的影響巴氏染色結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后正常形態(tài)率和頂體完整性明顯低于冷凍前(P<0.01);褪黑素+無保護劑微滴冷凍組復(fù)蘇后正常形態(tài)率和頂體完整性明顯高于其他3組(P<0.05)。見表2。

表2 褪黑素對精子復(fù)蘇后形態(tài)率和頂體完整性的影響Table 2 Effects of melatonin on morphological rate and acrosomal integrity of sperm after resuscitation

2.3 褪黑素對復(fù)蘇后精子質(zhì)膜完整率和DFI的影響低滲腫脹實驗和SCD檢測結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后質(zhì)膜完整率均明顯低于冷凍前(P<0.01),DFI明顯高于冷凍前(P<0.01)。微滴冷凍組、無保護劑微滴冷凍組復(fù)蘇后質(zhì)膜完整率高于常規(guī)冷凍組(P<0.05);褪黑素+無保護劑微滴冷凍組復(fù)蘇后質(zhì)膜完整率高于微滴冷凍組(P<0.05),而DFI明顯低于微滴冷凍組(P<0.05)。見表3。

表3 褪黑素對復(fù)蘇后精子質(zhì)膜完整率和DFI的影響Table 3 Effects of melatonin on plasma membrane integrity and DFI of sperm after resuscitation

2.4 褪黑素對復(fù)蘇后精子氧化應(yīng)激水平的影響氧化應(yīng)激結(jié)果顯示,4組復(fù)蘇后MDA明顯高于冷凍前,SOD以及GSH-Px明顯低于冷凍前(P<0.01)。與常規(guī)冷凍組相比,無保護劑微滴冷凍組、褪黑素+無保護劑微滴冷凍組MDA明顯降低(P<0.05),SOD及GSH-Px明顯升高(P<0.01);與微滴冷凍組相比,褪黑素+無保護劑微滴冷凍組MDA明顯降低(P<0.05)。褪黑素+無保護劑微滴冷凍組SOD、 GSH-Px較其他3組明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 褪黑素對復(fù)蘇后精子氧化應(yīng)激水平的影響Table 4 Effect of melatonin on oxidative stress level of sperm after resuscitation

3 討 論

常規(guī)精子冷凍技術(shù)相對成熟,廣泛應(yīng)用于生殖中心和精子庫,然而像睪丸切開顯微取精、睪丸穿刺取精以及附睪穿刺取精的精子等由于精子數(shù)量少、活力差,常規(guī)精子冷凍保存方法不僅回收率低,而且存活率低[6-7]。精子冷凍過程中冰晶的形成、保護劑在降溫以及升溫中對細胞和膜滲透性損傷的毒性效應(yīng),都嚴重影響精子的活力、結(jié)構(gòu)功能。凍融過程產(chǎn)生大量的活性氧(ROS )一方面會導(dǎo)致主要的精子功能缺陷;另一方面ROS 導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,從而損傷線粒體膜以及導(dǎo)致膜完整性降低,并誘導(dǎo)精子凋亡、DNA 碎片化[8-9]。因此,復(fù)蘇后無活動精子或精子損傷嚴重導(dǎo)致受精率低下,胚胎質(zhì)量下降,臨床妊娠率降低而流產(chǎn)率高等。對于稀少精子冷凍一直是研究的熱點和難點。

針對微量精子冷凍中的高濃度的滲透性保護劑的毒性作用,本研究采取無滲透性冷凍保護劑進行冷凍。無滲透性冷凍保護劑玻璃化冷凍是指不添加任何滲透性保護劑,通過添加蔗糖快速降溫,使精子迅速達到玻璃化狀態(tài),避免了冰晶形成對精子細胞膜和細胞骨架的物理損傷[10]。針對冷凍過程中的精子損傷以及氧化應(yīng)激,本研究通過添加褪黑素,褪黑激素合成的吲哚胺激素,由于褪黑激素具有很強的抗氧化和抗凋亡特性,而且在男性生育力保存和男性生殖系統(tǒng)中的發(fā)揮了極大的作用[11-12]。因此,本實驗以精子微滴進行無滲透性保護劑玻璃化冷凍,通過添加褪黑素研究微滴無保護劑玻璃化冷凍玻璃化冷凍微量精子的可行性及安全性。

研究結(jié)果顯示無滲透性冷凍保護劑冷凍復(fù)蘇后的精子前向運動和復(fù)蘇率要明顯優(yōu)于常規(guī)精子冷凍組,略好于微滴玻璃化冷凍組,這與葛斌等[13]在無保護劑玻璃化冷凍技術(shù)凍存 PESA 精子中的實用性研究的結(jié)果相一致,說明此方法相對常規(guī)冷凍和微滴玻璃化冷凍而言有優(yōu)勢;添加褪黑素的無保護劑冷凍組復(fù)蘇后的精子前向運動、復(fù)蘇率、正常形態(tài)率以及DFI均明顯優(yōu)于其他冷凍組,這與Mehaisen GMK等[14]研究顯示添加褪黑素能夠?qū)鋬龅墓u精子質(zhì)量起保護作用,降低冷凍過程脂質(zhì)過氧化、DNA 斷裂和凋亡的研究結(jié)果一樣。說明褪黑素在精子冷凍過程中能夠發(fā)揮保護作用,避免冷凍損傷。無保護劑微滴冷凍組和添加褪黑素冷凍組的復(fù)蘇存活率均高于微滴冷凍組和常規(guī)冷凍組,可能與蔗糖作在冷凍過程中提高了細胞外的滲透壓,避免細胞內(nèi)水分向外流出而造成細胞脫水而皺縮,減少了細胞內(nèi)冰晶形成,從而避免細胞遭受破壞[15]。精子質(zhì)膜和頂體是在精子冷凍和解凍過程中最易受損傷的部位,也是影響精子受精能力的重要因素之一。精子質(zhì)膜和頂體的完整性對精子維持自身新陳代謝、精子獲能和頂體反應(yīng)等能力有直接關(guān)系。添加褪黑素的無保護劑冷凍組復(fù)蘇后的精子質(zhì)膜和頂體的完整性均明顯優(yōu)于其他冷凍組,Fadl AM等[14]研究也顯示添加 1.0 mmol/L 褪黑素的精液稀釋劑可改善冷凍精液的運動性、活力、質(zhì)膜和頂體完整性,能夠提高受精率和出生率。在冷凍過程中,滲透壓變化通過改變鹽濃度來影響膜完整性和精子穩(wěn)態(tài)[16]。褪黑素能夠減少脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)滲透平衡和 pH 值,增加細胞內(nèi)抗氧化劑的合成,對抗氧化酶的活性和增加SOD、GPx、GSH和過氧化氫酶的蛋白質(zhì)有積極作用[17]。本研究也顯示褪黑素能夠降低MDA活性表達,增加SOD以及GSH-Px活性表達,從而發(fā)揮抗氧化保護作用。其機制可能與褪黑素增加線粒體呼吸鏈復(fù)合物成分的mRNA表達和復(fù)合物I、II、III和IV的活性,改善了冷凍精子的 OXPHOS,其具體機制可能通過PI3K/AKT以及HGF/c-Met信號通路發(fā)揮作用[18-20]。本研究使用正常精液進行稀釋成微量精子進行冷凍復(fù)蘇,不能直接反應(yīng)嚴重少精弱癥精子、睪丸穿刺、附睪穿刺以及睪丸切開顯微取精精子的冷凍復(fù)蘇后狀態(tài),有一定局限性。后期需要進一步研究驗證無滲透性微滴玻璃化冷凍對睪丸穿刺精子冷凍復(fù)蘇的影響,以便為嚴重少精弱癥精子、睪丸穿刺、附睪穿刺以及睪丸切開顯微取精精子的冷凍起一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述,無滲透性微滴玻璃化冷凍有其獨特優(yōu)勢,能夠有效保存微量精子,而添加褪黑素能夠明顯提高精子的PR、活力、正常形態(tài)、DFI、質(zhì)膜和頂體完整性,其原因可能與降低MDA,增加SOD以及GSH-Px表達有關(guān)。添加褪黑素進行無保護劑微滴法玻璃化冷凍可能是一種安全有效的冷凍方法。