周啟慧，楊俊芳，尹貴波，劉玉衛(wèi)，鞏校東，賈振華，谷守芹

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 / 華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河北省農(nóng)業(yè)微生物生物信息利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000；2.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050051）

玉米大斑病是一種嚴(yán)重威脅玉米產(chǎn)量的葉部真菌性病害。引起該病害的病原菌為玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）［1］，該病菌通過(guò)感染玉米葉片使其形成局部病變和壞死，從而影響玉米的光合作用［2］。該病害主要發(fā)生在氣溫20 ～25 ℃且高濕度的條件下，其早期病斑呈水漬狀，青灰色斑點(diǎn)；后期形成邊緣暗褐色，中央黃褐色或灰褐色的梭形病斑［3-6］。當(dāng)環(huán)境濕度高時(shí)，病斑表面則附著灰黑色的霉層［7］。嚴(yán)重時(shí)可加重莖腐病的危害，導(dǎo)致玉米倒伏，使玉米產(chǎn)量降低［8-11］。因此，深入研究玉米大斑病菌的致病機(jī)理，對(duì)該病害的防治和研發(fā)新型抗真菌藥物具有深遠(yuǎn)意義。

真菌與宿主之間的相互作用可以通過(guò)多種分子機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中，絲氨酸蛋白酶（Serine protease）是真菌分泌到宿主體內(nèi)的重要毒性因子之一［12］；絲氨酸蛋白酶超家族成員具有外肽酶、內(nèi)肽酶、寡聚肽酶等活性的特點(diǎn)。其物種跨度大，廣泛存在于病毒、細(xì)菌以及真核生物體內(nèi)［13］，且執(zhí)行的生理功能也是多種多樣的，例如與細(xì)胞的水解酶活性、細(xì)胞粘附力、芽管的形成能力相關(guān)［14］，在細(xì)胞分化和病原入侵等過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用［15］。在真核生物中，蛋白酶執(zhí)行各種生理功能時(shí)不是直接完成的，而是通過(guò)一系列的酶或蛋白質(zhì)共同作用完成［16］。在此過(guò)程中，絲氨酸蛋白酶扮演著重要的角色，作為上游激活因子或下游執(zhí)行因子行使功能，在執(zhí)行生理功能時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。有研究表明，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）作為哮喘病患者患病的一個(gè)重要誘因，其主要過(guò)敏原很有可能是分泌量最高的絲氨酸蛋白酶［18］。在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中，絲氨酸蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)外分布較廣，干擾絲氨酸蛋白酶基因后的稻瘟菌突變體氣生菌絲較少，致病性降低，表明絲氨酸蛋白酶與稻瘟菌的致病性及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)［19］。

目前，絲氨酸蛋白酶在玉米大斑病菌中的作用尚未明確。本研究以野生型玉米大斑病菌cDNA 為模版，克隆絲氨酸蛋白酶StSp8基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體，利用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白［20-22］，從而獲得了StSp8 蛋白。分析病菌5 個(gè)重要發(fā)育時(shí)期（菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘）的qRT-PCR 數(shù)據(jù)，明確該基因的表達(dá)模式。本研究不僅為研究探索絲氨酸蛋白酶在玉米大斑病菌中的具體功能奠定基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)病害防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

玉米大斑病菌野生型菌株01-23、玉米感病品種‘B73’、原核表達(dá)載體pET28a，均由華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α 和BL21（DE3）購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD-19、小型質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于OMEGA 公司；便攜型植物RNA 快速提取試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa 公司；引物及測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)；利用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）預(yù)測(cè)基因的亞細(xì)胞定位；利用GSDS 2.0 軟件分析基因結(jié)構(gòu)信息；利 用prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html） 和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)NCBI 查詢(xún)StSp8 同源蛋白， 并用SMART 軟件（http://www.embl-hei delberg.de）分析保守結(jié)構(gòu)域；利用ClustalX 2.1 軟件將StSp8 同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA7.0 軟件的最大似然法（maximum likelihood estimation, MLE）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 玉米大斑病菌RNA 提取及cDNA 合成

取在PDA 培養(yǎng)基中25 ℃黑暗培養(yǎng)10 ～15 d，獲得生長(zhǎng)狀態(tài)良好的玉米大斑病菌菌株01-23，刮取氣生菌絲后置于液氮中研磨，按照呂潤(rùn)玲［23］的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄；檢測(cè)RNA 的分光光度值。將合格樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)分離純化后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 玉米大斑病菌絲氨酸蛋白酶基因StSp8 的克隆

將釀酒酵母StSp8基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行本地BLAST，從而獲取玉米大斑病菌StSp8基因氨基酸序列及蛋白ID 號(hào)，根據(jù)基因編號(hào)在JGI（http://genome,jgi.doe.gov）中查找到相應(yīng)序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0，設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物序列（StSp8-F：5'-ATGAG GTACACGCCTCATC-3'、StSp8-R：5'-TTAGTGGCTAGCGAGGCG-3'）。送交生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板進(jìn)行基因cDNA 序列的PCR 擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。將包含目的片段的瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，連接克隆載體pMD19 并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，并將陽(yáng)性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 玉米大斑病菌絲氨酸蛋白酶基因StSp8 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確的菌液提取質(zhì)粒，以含有目的基因的質(zhì)粒為模板，酶切后連接至終載pET28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒。挑取單菌落，進(jìn)行菌液 PCR 驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。并將驗(yàn)證結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株，進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證。

1.6 玉米大斑病菌絲氨酸蛋白酶基因StSp8 的原核表達(dá)

挑取已鑒定的陽(yáng)性克隆，置于5 mL 含有100 μg/mL 卡納霉素抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，在37℃、轉(zhuǎn)速220 r/min 的條件下震蕩培養(yǎng)，在600 nm 吸光度（A600）測(cè)定分光光度值，達(dá)到0.6 時(shí)，用1 mol/L 的IPTG 誘導(dǎo)6 h，收集菌體于4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，向沉淀中加入24 μL 的H2O 和6 μL 的上樣buffer，100 ℃煮沸10 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min。取15 μL 蛋白樣品上清液上樣，10% SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。

1.7 玉米大斑病菌不同發(fā)育時(shí)期和侵染時(shí)期材料的收集

收集玉米大斑病菌5 個(gè)典型的發(fā)育時(shí)期的材料（菌絲、分生孢子、芽管、附著胞、侵入釘），選取在PDA 上25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 左右的野生型菌株，用去尖藍(lán)槍頭傾斜刮取菌絲體。選取PDA 上25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d 左右的病菌，用棉簽刮去其氣生菌絲，將剩余基生菌絲繼續(xù)培養(yǎng)3 d，加入8 mL 左右無(wú)菌水，收集分生孢子懸浮液，12 000 r/min 離心，獲得分生孢子。在覆蓋有玻璃紙的水瓊脂培養(yǎng)基上加入分生孢子懸浮液，黑暗培養(yǎng)4 h 后收集芽管，10 h后收集附著胞，16 h 后收集侵入釘。將收集的分生孢子懸浮液均勻噴灑在3 葉期的玉米‘B73’葉片上，收集病菌侵染0、24 和72 h 的玉米葉片。以上試驗(yàn)樣品需要設(shè)置3 次重復(fù)。

1.8 StSp8 基因的表達(dá)模式分析

利用 Primer Premier 3.0 軟件設(shè)計(jì)StSp8基因的qRT-PCR 引物， 并送至生工生物工程（ 上海） 股份有限公司合成。（RT-StSp8：5'-C T C G A C A G A G A C G AT C C A C A-3'；RTStSp8-R：5'-TCAAAATGACCCGAGTAGCC-3'）以Tubulin 作為內(nèi)參基因，以5 個(gè)發(fā)育和3 個(gè)侵染時(shí)期的cDNA 為模板對(duì)該基因進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.2 μL，2×Perfect-Start Green qPCR SuperMix 5 μL，ddH2O 3.6 μL。qPCR 程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35 次。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，利用Graphpad Prism 6.0.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌StSp8 蛋白的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

利用ExPASy Proteomics Server 的在線軟件預(yù)測(cè)絲氨酸蛋白酶StSp8 的理化性質(zhì)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，StSp8基因編碼的蛋白包含533 個(gè)氨基酸，分子式為C2503H3928N696O808S15，總原子數(shù)為7 950，相對(duì)分子質(zhì)量為57 179.80 kD 理論等電點(diǎn)（pI）5.94，表明該蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì)。StSp8 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為35.36，表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。另外，StSp8 蛋白的平均親水系數(shù)為-0.493，表明該蛋白是親水性蛋白。利用WOLF PSORT 在線預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，推斷其可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 玉米大斑病菌StSp8 蛋白的結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用GSDS 2.0 軟件分析StSp8基因結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)該基因有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子（圖1A）。利用SMART 在線軟件對(duì)StSp8 保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白第1 ～15 位氨基酸形成信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、第43 ～135 位氨基酸形成Inhibitor-I9結(jié)構(gòu)域，第174 ～458 位氨基酸形成Peptidase-S8（圖1B）。采用SOPMA 進(jìn)行StSp8 的編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該蛋白具有3 種二級(jí)結(jié)構(gòu)，即α 螺旋（αhelix, Hh）、無(wú)規(guī)則卷曲（random coil, Cc）和延伸鏈（extended strand,Ee）（圖1C）。進(jìn)一步對(duì)StSp8 編碼蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶StSp8 的編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（alpha helix）占36.02%、延伸鏈（extended strand）占13.13%、無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）占50.84%。折疊后呈倒L 型，包含有1 個(gè)由7 股α-螺旋和β 折疊組成的平行結(jié)構(gòu)，具有Asp/Ser/His 三元催化位點(diǎn)（圖1D）。

圖1 StSp8 基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域及高級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Conservative domain and advanced structure analysis of StSp8

2.3 StSp8 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步研究玉米大斑病菌與其他真菌間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)該基因蛋白序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，基于巴恩斯鏈格孢（Alternaria burnsii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、小麥鏈格孢菌（Alternaria alternata）等真菌物種的氨基酸序列，利用MEGA 7.0 最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。分析結(jié)果表明，玉米大斑病菌StSp8 在第8 支，與番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）的進(jìn)化關(guān)系最近，與煙草彎孢菌葉斑?。–urvularia clavata）、玉米新月彎孢菌（Curvularia lunata）和釀酒酵母（S.cerevisiae）的關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 StSp8 系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of StSp8

2.4 StSp8 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

利用NanoDrop 分析儀進(jìn)行RNA 純度測(cè)定，RNA 的A260/A280在1.9 ～2.0 之間，表明提取的RNA 質(zhì)量較好。以RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，StSp8-F 和StSp8-R 為引物，擴(kuò)增出1 條1 600 bp左右的單一特異性條帶（圖3A）。

圖3 StSp8 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of the vector for prokaryotic expression of StSp8 gene

經(jīng)回收純化產(chǎn)物后經(jīng)測(cè)序通過(guò)DNAMAN 軟件比對(duì)與預(yù)期結(jié)果一致，表明已獲得絲氨酸蛋白酶StSp8基因序列。

以pET28a 載體為骨架構(gòu)建原核表達(dá)載體，將StSp8CDS 序列連接終載后菌液檢測(cè)能擴(kuò)增出1 條1 600 bp 左右的單一特異性條帶（圖3B），提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證能檢測(cè)到1 條1 600 左右的目的條帶以及載體條帶（圖3C）。表明目的基因成功插入原核表達(dá)載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3）后菌液PCR 能檢測(cè)到1 條1 600 bp 左右的目的條帶（圖3D）。表明目的基因已轉(zhuǎn)入BL21（DE3）表達(dá)菌株。SDS-PAGE 電泳結(jié)果可知，與未誘導(dǎo)重組菌相比，IPTG 誘導(dǎo)的重組菌在63 ～75 kD 之間出現(xiàn)目的條帶（圖4）。結(jié)果初步表明含有StSp8基因的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中已成功表達(dá)。

圖4 StSp8 蛋白的SDS-PAGE 電泳分析Fig.4 Analysis of StSp8 fusion protein by SDS-PAGE

2.5 StSp8 基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育及侵染過(guò)程中的表達(dá)模式分析

基因表達(dá)模式的分析可對(duì)基因功能研究起重要作用，為進(jìn)一步探索StSp8的功能，利用qRT-PCR數(shù)據(jù)分析了該基因在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘時(shí)期和該基因在侵染玉米0、24、72 h 的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StSp8在上述5 個(gè)發(fā)育時(shí)期均有不同水平的表達(dá)。與菌絲時(shí)期相比，分生孢子、芽管、附著胞、侵入釘時(shí)期的StSp8基因表達(dá)量分別為菌絲時(shí)期的1.31、2.57、1.44、0.68 倍，StSp8在芽管時(shí)期表達(dá)量最高，在侵入釘時(shí)期最低（圖5A），說(shuō)明StSp8基因參與病菌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控過(guò)程。在侵染玉米的過(guò)程中，StSp8的表達(dá)量在侵染24 h 時(shí)最高，為0 h 的3.45 倍；在72 h 時(shí)降低，為0 h 的2.78 倍（圖5B），表明該基因在侵染中期發(fā)揮作用。

圖5 玉米大斑病菌StSp8 的表達(dá)模式分析Fig.5 Analysis of the expression pattern of StSp8 in S.turcica

3 結(jié)論與討論

研究表明，絲氨酸蛋白酶作為一種潛在的致病因子在玉米大斑病菌中的作用機(jī)理目前尚未明確。本研究克隆了StSp8基因，cDNA 序列全長(zhǎng)為1 602 bp，編碼533 個(gè)氨基酸，StSp8全基因含有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子，推測(cè)該蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。在真菌植物病原菌中通過(guò)分泌組分析篩選出了與StSp8高度同源的基因，與寄主大范圍壞死相關(guān)，是一種候選效應(yīng)因子［14］。在分布于水稻細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸蛋白酶OsPOP5 的研究中，將其導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)的pET32a 載體中，發(fā)現(xiàn)OsPOP5的表達(dá)可以增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)脫水、高溫和高鹽度的耐受性，表明OsPOP5可能在應(yīng)激條件下發(fā)揮保護(hù)作用［24］。本試驗(yàn)在克隆絲氨酸蛋白酶StSp8基因的基礎(chǔ)上，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其編碼蛋白包含信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、Inhibitor-I9 結(jié)構(gòu)域和Peptidase-S8 結(jié)構(gòu)域，在原核表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)。初步驗(yàn)證含有絲氨酸蛋白酶基因StSp8的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中已成功表達(dá)約65 kD 的重組蛋白。純化后的蛋白將用于測(cè)定絲氨酸蛋白酶StSP8 的酶活及病菌侵染玉米葉片后StSp8蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。

在脈紋孢菌（Neurospora crassa）中，絲氨酸蛋白酶Pox1 對(duì)于細(xì)胞壁的形成和完整性是必需的，敲除pox1基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常并增加對(duì)細(xì)胞壁損傷劑的敏感性［25］。SPMo1的缺失會(huì)減少稻瘟病菌的分生孢子、氣生菌絲的形成和自噬體的積累［13］。通過(guò)qRT-PCR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，StSp8基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都表達(dá)，但在芽管時(shí)期表達(dá)量最高，在侵染玉米的過(guò)程中表達(dá)量在侵染24 h 時(shí)最高，在72 h 時(shí)降低，由此推測(cè)，StSp8基因可能參與玉米大斑病菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程，但需要進(jìn)一步通過(guò)創(chuàng)制該基因的突變體進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為后期進(jìn)一步研究絲氨酸蛋白酶StSp8 的生物化學(xué)和分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。