朱愛臣，朱凱晴，孫 鵬，張建樓，李 妍，霍書英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）

白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）簡稱白介素，是20 世紀(jì)80 年代以來發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素21（IL-21）是一種Ⅰ型細(xì)胞因子，由4 個α 螺旋束組成，主要由自然殺傷性T 細(xì)胞（NKT）、濾泡輔助性T 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞產(chǎn)生，作為Th17 細(xì)胞的自分泌生長因子發(fā)揮作用，并在自身免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。例如，通過促進(jìn)Tfh 和Th17細(xì)胞的增殖和發(fā)育，平衡輔助T 細(xì)胞亞群，誘導(dǎo)B細(xì)胞生成和分化為漿細(xì)胞，以及增強(qiáng)免疫球蛋白的產(chǎn)生［2］。

IL-21 具有增強(qiáng)或抑制免疫的功能，它不僅在抗腫瘤和抗病毒反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，而且對促進(jìn)自身免疫疾病和炎癥性疾病發(fā)展的炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用［1］。許多人類免疫介導(dǎo)的疾病，如炎癥性腸?。?］、銀屑?。?］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［5］和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［6］，IL-21 均表現(xiàn)出不同程度的分泌增強(qiáng)。有研究表明，給小鼠注射外源性IL-21 可增強(qiáng)其自身免疫［7］。還有研究表明IL-21 可以通過誘導(dǎo)IL-10 來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，揭示了這種細(xì)胞因子的免疫抑制作用［8］。為探究雞IL-21 的生物功能，本研究擴(kuò)增了IL-21 基因并利用人和雞偏愛的密碼子對其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，首次通過真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因的高效表達(dá)；MTT法檢測了純化后的重組蛋白IL-21 的淋巴細(xì)胞增殖功能；利用生物信息學(xué)軟件分析了雞IL-21 基因序列以及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究雞IL-21 生物學(xué)功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

真核表達(dá)載體pcDNA3.1A 由本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；人胚胎腎細(xì)胞（HEK）293T 為實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞系；京紅1 號蛋雞購于河北大午農(nóng)牧集團(tuán)有限公司；Trizol、Lipo-fectamine 3000 試劑購于Thermo Scientific（ 美國）；His Tag Monoclonal Antibody 購于Cell Signaling Technology（美國）；Goat Anti-Mouse IgG H&L/AP 購于Bioss（北京）；BCIP /NBT 底物顯色試劑盒購于Solarbio（北京）； DL2000 DNA Marker、Blue Plus?Protein Marker 購于TransGen BIotech（北京）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco（美國）；MTT 購于Sigma（ 德國）；His-Tagged Protein Purification Kit、BCA Protein Assay Kit 購于CWBIO（北京）。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy 服務(wù)器上的ProtParam 工具預(yù)測IL-21 蛋白分子質(zhì)量的預(yù)測，使用SignalP-6.0 和TMHMM-2.0 在線軟件對IL-21 蛋白進(jìn)行信號肽和跨膜區(qū)域預(yù)測，應(yīng)用NetNGlyc-1.0 和NetPhos-3.1 在線軟件對IL-21 蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測。

1.3 IL-21 基因的克隆、真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank 雞IL-21 基因的全長序列（NM_001024835.1），通過Primer 5.0 軟件在開放閱讀框（ORF）兩端設(shè)計(jì)1 對引物，在上游引物中引入酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ；在下游引物中引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ，以便于將克隆的IL-21 基因與載體連接。IL-21 wt（wild type，wt）-F：5′-CCCAAGCTT（Hind Ⅲ）ATGGAGAGGATGATTATTTTC-3′；IL-21wt-R：5′-CGCGGATCC（BamHⅠ）TCAAATAGTAGATTTTCCGTAG-3′。首先從新鮮的雞脾臟提取淋巴細(xì)胞，通過Trizol 法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板擴(kuò)增IL-21 基因。將PCR 產(chǎn)物和pcDNA3.1A 載體分別通過Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切，將酶切后回收的基因片段和載體片段通過T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，獲得pcDNA-IL-21wt/MH 重組質(zhì)粒。

1.4 IL-21 密碼子優(yōu)化、表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)人和雞偏愛的密碼子對雞IL-21 進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造，優(yōu)化后的基因序列用primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并在上游引物引入酶切位點(diǎn)XhoⅠ；在下游引物引入酶切位點(diǎn)SfuⅠ。上游引物為：IL-21opt（Optimized，opt）-F：5′-3′CCCGCTCGAG（XhoⅠ）ACACCATGGAAAGAATGATTATTTTTTGC，下游引物為：IL-21opt-R：5′-3′GGGTTT TTCGAA（SfuⅠ）AATTGTAGATTTTCCATATCTTTC 將引物序列和優(yōu)化后的基因序列共同送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成，連接至pUC-57 載體。命名為pUC-57-IL-21opt。以合成后載體為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過XhoⅠ和SfuⅠ雙酶切連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1A 上，連接方法同上，連接完成后并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。獲得pcDNA-IL-21opt/MH 重組質(zhì)粒。

1.5 HEK293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、重組蛋白的表達(dá)及純化

采用Lipo-fectamine 3000 實(shí)現(xiàn)IL-21 基因在HEK293T 細(xì)胞的瞬時表達(dá)。將pcDNA-IL-21wt/MH、pcDNA-IL-21opt/MH 和pcNDA3.1A 空載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后分別收集表達(dá)培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 Western blot 檢測表達(dá)培養(yǎng)基和裂解液上清（同時設(shè)pcDNA-3.1A 作為陰性對照），用ImageJ 軟件分析野生型和優(yōu)化型的表達(dá)量。將樣品緩慢的通過含有Ni-NTA 瓊脂糖填料的重力柱上，用洗脫緩沖溶液（300 mmol/L 咪唑，pH8.0），洗脫目的蛋白，收集洗脫液，Western-blot 檢測純化后的蛋白。

1.6 重組蛋白對脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響

雞脾臟淋巴細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行，取SPF 雞新鮮脾臟（摘取2 h 之內(nèi)），利用淋巴分離液分離脾臟淋巴細(xì)胞，分離的淋巴細(xì)胞用含10%FBS，1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基懸浮，以濃度為1×106cells/mL 接種于96 孔板中（每孔50 μL 懸浮液），對照組加入BSA（15 mg/L），IL-21 分別設(shè)為0、1、5、10、15、20 mg/L，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，37 ℃，5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），加入100 μL DMSO 溶解紫黑色結(jié)晶，在2 h 內(nèi)測量OD490nm值。淋巴細(xì)胞增殖能力用淋巴細(xì)胞增值指數(shù)SI（Stimuate index）來表示，SI=實(shí)驗(yàn)組OD490nm值/對照組OD490nm值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA 分析實(shí)驗(yàn)組的差異性，****表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P值為＜0.000 1，ns表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，P值為＞0.05，數(shù)據(jù)按“x±s”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 IL-21 基因序列及其編碼蛋白分子質(zhì)量的預(yù)測 Genbank 預(yù)測雞IL-21 的序列長度為438 bp，編碼145 個氨基酸，計(jì)算分析IL-21 蛋白分子質(zhì)量約為17 ku。

2.1.2 IL-21 蛋白跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測 經(jīng)TMHMM-2.0 在線軟件對IL-21 進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，結(jié)果顯示跨膜區(qū)域位于第4 ～22 個氨基酸之間（圖1）。運(yùn)用SignalIP-6.0 對IL-21 進(jìn)行信號肽位點(diǎn)預(yù)測分析，顯示信號肽切割位點(diǎn)位于19 和20 位氨基酸之間（圖2），表明雞IL-21 為跨膜分泌性蛋白。

圖1 雞IL-21 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.1 Transmembrane domain prediction of IL-21 protein in chicken

圖2 雞IL-21 蛋白信號肽切割位點(diǎn)預(yù)測Fig.2 Signal peptide cleavage site prediction of IL-21 protein in chicken

2.1.3 IL-21 蛋白糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 對IL-21 的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析，結(jié)果顯示共預(yù)測到19 個磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）10 個，蘇氨酸（Thr）7 個，酪氨酸（Tyr）2 個（圖3）。使用NetNGlyc-1.0 在線軟件進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測，結(jié)果顯示，雞IL-21 氨基酸序列沒有潛在的O 糖基化位點(diǎn)（圖4），但是在第83 位天冬酰胺含有1 個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。

圖4 雞IL-21 蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測Fig.4 Glycosylation site prediction of IL-21 protein in chicken

2.2 雞IL-21 基因克隆與鑒定

從雞脾臟淋巴細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增IL-21 基因。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5A 可見，擴(kuò)增的PCR 片段約為438 bp，符合預(yù)期片段大小。使用Hind Ⅲ和BamHⅠ將此DNA 片段插入pcDNA3.1A 載體上構(gòu)建成pcDNA-IL-21wt（圖5B）。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測序，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)擴(kuò)增的IL-21序列與GenBank（NM_001024835.1）相比，有2 個堿基突變（141C →141T，312C →312T），但不影響編碼的氨基酸序列（圖5D）。重組載體經(jīng)雙酶切，切出預(yù)期大小為438 bp 的片段（圖5C），表明構(gòu)建的載體結(jié)構(gòu)正確。

圖5 PCR 產(chǎn)物鑒定、載體構(gòu)建、酶切鑒定和核苷酸序列比對Fig.5 Identification of the PCR product, vector construction, enzyme digestion identification and nucleotide sequence alignment

2.3 雞IL-21 基因的優(yōu)化與鑒定

為了提高雞IL-21 在HEK293T 細(xì)胞上的表達(dá)水平，根據(jù)人和雞偏愛的密碼子對IL-21 進(jìn)行優(yōu)化改造（圖6C），并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成并連接至pUC-57 載體。經(jīng)過對比，優(yōu)化后的IL-21 相對于野生型IL-21 的核苷酸序列相似性為79.09%，優(yōu)化后的序列與真核表達(dá)載體pcDNA3.1 連接并與Myc/His 標(biāo)簽相融合，命名為pcDNA-IL-21opt/MH（圖6A）。重組載體經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果正確大小為438 bp（圖6B）。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測序。

圖6 載體構(gòu)建、酶切鑒定和優(yōu)化核苷酸序列比對Fig.6 Vector construction, enzyme digestion identification and nucleotide sequence alignment

2.4 雞IL-21 蛋白在HEK293T 細(xì)胞表達(dá)的鑒定和純化

通過Lipo-fectamine 3000 法將pcDNA-IL-21wt/MH 和pcDNA3.1A-IL-21opt/MH 轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中（同時轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1A），Western blot 檢測培養(yǎng)基上清和細(xì)胞裂解液上清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大約26 ku 處有均有1 條特異性條帶（圖7A）。根據(jù)ImageJ 灰度值分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的IL-21 基因在細(xì)胞上清中的表達(dá)比野生型在細(xì)胞上清中的表達(dá)量高大約4.4 倍（P＜0.000 1）（表1，圖7C），將鑒定后的蛋白經(jīng)Ni-NTA 瓊脂糖凝膠粒純化，Western-blot 檢測蛋白純化后的效果（圖7B）。

圖7 HEK293T 細(xì)胞表達(dá)的鑒定和純化Fig.7 Identification of HEK293T cell expression and purification

2.5 雞IL-21 蛋白生物活性分析

為了鑒定純化后的重組IL-21 蛋白是否有生物活性，通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT 法）檢測其對淋巴細(xì)胞的增殖效果。結(jié)果表明，隨著重組IL-21蛋白濃度的增高，淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)逐漸升高，表明IL-21 對雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，純化后的IL-21 蛋白有良好的生物活性（圖8）。

圖8 MTT 檢測脾臟淋巴細(xì)胞的增殖Fig.8 The proliferation of splenic lymphocyte was detected by MTT

3 結(jié)論與討論

IL-21 是2000 年由Parrish-Novak 等發(fā)現(xiàn)的一種多效性的新型免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子［10］，自被發(fā)現(xiàn)以來，人們針對其來源和體內(nèi)外生物學(xué)功能進(jìn)行了廣泛的研究。人們研究發(fā)現(xiàn)，IL-21 通過其受體IL-21R 發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-21R 廣泛表達(dá)免疫細(xì)胞（T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞、DCs 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）和非免疫細(xì)胞（上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞），因此IL-21 具有廣泛的生物學(xué)功能［11］。目前對人、豬和牛等的IL-21 研究較多，但是對雞的IL-21 報道較少。

為了研究雞IL-21，本研究根據(jù)GenBank 發(fā)布的雞IL-21 預(yù)測序列，利用RT-PCR 從雞脾臟淋巴細(xì)胞中克隆了IL-21cDNA，通過軟件分析了雞IL-21與其他物種的序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并首次成功在真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和制備了IL-21 重組蛋白。構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1A-IL-21/MH，與Genbank 中序列進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，第141 位核苷酸由C 突變?yōu)門，第312 位核苷酸由C 突變?yōu)門，但不影響氨基酸序列。Western blot 在培養(yǎng)基上清和細(xì)胞裂解液上清中在大約26 ku 處同時檢測到特異性條帶，經(jīng)過優(yōu)化密碼子之后的IL-21 蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.000 1），表明構(gòu)建的真核表達(dá)載體可介導(dǎo)IL-21 在真核細(xì)胞中分泌表達(dá)，這與預(yù)測IL-21基因含有信號肽結(jié)果一致，但是蛋白大小明顯高于理論計(jì)算值17 ku，這可能是預(yù)測序列中含有1 個N-糖基化位點(diǎn)所引起的。為了檢測表達(dá)的蛋白是否具有生物活性，本試驗(yàn)中利用Ni-NTA 瓊脂糖凝膠純化系統(tǒng)將表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)MTT 法檢測，發(fā)現(xiàn)純化后的IL-21 蛋白能夠促進(jìn)雞脾臟淋巴細(xì)胞體外的增殖，表明表達(dá)的蛋白具有良好的生物活性，這為進(jìn)一步研究雞IL-21 蛋白的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

糖基化是常見的蛋白翻譯后修飾，它可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。有研究表明，在蛋白表達(dá)過程中，用糖基化抑制劑衣霉素去抑制蛋白糖基化，從而可以改變蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量［12］。糖基化是一種將聚糖與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)連接的酶過程。在真核生物中約有一半的糖蛋白是糖基化的，糖基化的變化可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使病毒免疫逃逸，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［13］。N-糖基化是最常見的蛋白質(zhì)修飾類型之一，它在正常的生理過程中發(fā)揮著重要作用［14］，如宿主與病原體的相互作用、細(xì)胞分化、遷移、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞追蹤和信號傳遞［15］。雞的IL-21 含有1 個N-糖基化位點(diǎn)，雞的IL-21 是否具有以上功能還有待進(jìn)一步研究。

信號肽是蛋白質(zhì)在N 端的一段短肽，一般由15 ～30 個氨基酸組成，主要攜帶蛋白質(zhì)的分泌信息，具有平衡蛋白質(zhì)的翻譯速度和轉(zhuǎn)運(yùn)速度的功能［16-17］。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基上清中檢測到了蛋白的表達(dá)，這與生物信息學(xué)軟件SignalIP-6.0 分析在IL-21 的第1 ～19 位氨基酸為其信號肽序列相一致。

真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來的蛋白具有正確的蛋白質(zhì)折疊和糖鏈修飾［19］，并且表達(dá)出來的蛋白通常具有良好的生物活性。不同于真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)具備成本較低、產(chǎn)量大，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但是，真核基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中往往因?yàn)殄e誤的折疊而形成不可溶性的包涵體，沒有生物活性，需要對包涵體進(jìn)行復(fù)性，才可恢復(fù)蛋白質(zhì)的生物活性，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期延長，增加操作難度。本試驗(yàn)通過真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)雞IL-21 蛋白，便于后期對其生物功能進(jìn)行研究。