齊小坤，孟祥熹，趙志明，袁夢(mèng)婷，楊志慧，武江昊，王進(jìn)茂

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

BBXs（B-box zinc finger transcription factors）屬于鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族，其N(xiāo) 端包含1 ～2 個(gè)B-box 結(jié)構(gòu)域［1］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，BBX基因家族根據(jù)B-box 結(jié)構(gòu)域以及C 端是否含有CCT 結(jié)構(gòu)域被分為5 個(gè)亞族［2］。自1995 年首次在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，BBX基因的生物學(xué)功能被廣泛研究［3］。大量研究表明，BBX基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫反應(yīng)等多種生理生化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。例如，擬南芥中，AtBBX28和AtBBX29基因可以相互作用并共同控制開(kāi)花時(shí)間［4］。此外，AtBBX30和AtBBX31作為光形態(tài)發(fā)生的抑制因子，在調(diào)節(jié)植物光形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［5］。在脅迫方面，擬南芥AtBBX18基因與植株的耐熱性相關(guān)［6］。過(guò)表達(dá)蘋(píng)果MdBBX10基因可以提高擬南芥的耐旱性和耐鹽性［7］。

楊樹(shù)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)型樹(shù)種，因其生長(zhǎng)快，適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣泛，是林木基因組學(xué)研究的模式物種［8］。然而，楊樹(shù)在種植過(guò)程中所經(jīng)常遭受的干旱、土壤鹽漬化、重金屬離子和極端溫度等非生物脅迫，成為制約其生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素［9］。因此，挖掘楊樹(shù)響應(yīng)非生物脅迫的目標(biāo)基因，以及探究和了解楊樹(shù)應(yīng)答逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)于楊樹(shù)抗性育種和遺傳改良具有重要意義。BBX基因的抗逆作用在多個(gè)物種中被證實(shí)，因此對(duì)BBX基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，了解PtBBX基因家族成員的的物理和化學(xué)特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系和表達(dá)模式，對(duì)深入解析毛果楊BBX基因的功能和楊樹(shù)的抗性改良奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛果楊BBX 基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

毛果楊參考基因組下載于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。首先，通過(guò)HMMER 3.1 軟件利用從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）中下載的BBX 蛋白相對(duì)應(yīng)的隱馬爾科夫模型（PFPF00643），從毛果楊基因組中搜索獲得候選BBX 蛋白序列（P＜ 0.001）。同時(shí)，利用從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/）［10］下載的已確定的擬南芥BBX 蛋白序列作為種子序列BLASTP［11］檢索毛果楊基因組數(shù)據(jù)中的BBX 蛋白序列（E-value ＜ 1e-3）。合并兩種方法所獲得的候選序列，手動(dòng)去除冗余序列后，將所有的BBX 蛋白序列提交到InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）［12］和CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）［13］數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行驗(yàn)證。最后，利用ExPASy（http://cn.expasy.org/tools）和WoLF PSORT（http: //www.genscript.com/wolf-psort.html）在線軟件分別計(jì)算毛果楊BBX 蛋白序列的長(zhǎng)度、等電點(diǎn)和分子量，以及預(yù)測(cè)BBX 蛋白的亞細(xì)胞位置。

1.2 毛果楊BBX 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類(lèi)

使用MEGA 6.0 軟件中的Clustal W 工具對(duì)鑒定出的毛果楊BBX蛋白序列和下載的擬南芥BBX蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)，參數(shù)默認(rèn)［14］。然后基于多序列比對(duì)的結(jié)果，采用鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。最后根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)BBX家族基因進(jìn)行分類(lèi)。

1.3 毛果楊BBX 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

根據(jù)毛果楊基因組數(shù)據(jù)的注釋信息，使用TBtools 軟件繪制PtBBXs基因家族成員的結(jié)構(gòu)圖。使用MEME 在線軟件（http://meme-suite.org/tools/meme）分析PtBBXs 蛋白序列的Motif，參數(shù)設(shè)計(jì)如下：Motif 的最大數(shù)量為10，最大Motif 寬度為100，最小Motif 寬度為6［15］。

1.4 毛果楊BBX 家族基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

從毛果楊基因組中提取BBX家族基因起始密碼子上游1 500 bp 序列作為PtBBXs基因的啟動(dòng)子序列， 利用PlantCARE 在線網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［16］對(duì)順式作用元件進(jìn)行分析。

1.5 毛果楊BBX 家族基因的染色體定位及加倍事件分析

為了更好的了解PtBBXs基因家族成員間的加倍事件，使用MCScanX（Multiple Collinearity Scan toolkit）來(lái)鑒定基因組內(nèi)的共線性［17］。與此同時(shí)，使用TBtools 軟件中的Dual Systeny Plotter 程序分析并展示毛果楊與擬南芥間直系同源BBX基因的共線性關(guān)系［18］。

1.6 毛果楊BBX 家族基因的表達(dá)模式分析

從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載楊樹(shù)不同組織中基因的表達(dá)數(shù)據(jù)集（Accession Number: GSE13990）［19］，分析毛果楊BBX家族基因在不同組織中的表達(dá)情況。同時(shí)，利用課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序獲得的楊樹(shù)在茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、鹽堿、干旱、高溫和低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析毛果楊BBX家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式。利用TBtools 軟件對(duì)PtBBXs基因的表達(dá)數(shù)據(jù)取以2 為底的對(duì)數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)化處理）后，繪制成熱圖［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊BBX 基因家族成員的鑒定與分析

通過(guò)生物信息學(xué)分析，最終在毛果楊基因組中篩選獲得28 個(gè)BBX基因家族成員，并按照其在染色體上的位置順序依次命名為PtBBX1-PtBBX28?；虻睦砘再|(zhì)分析結(jié)果表明，除PtBBX27和PtBBX28基因未錨定到參試基因組數(shù)據(jù)的染色體外，其余PtBBXs基因不均勻分布于15 條染色體上。PtBBXs基因的編碼序列長(zhǎng)度差異較大，介于555 bp（PtBBX10）～ 1 545 bp（PtBBX1）間變化，編碼的氨基酸殘基數(shù)量介于184 ～514 個(gè)，CDS 序列和蛋白質(zhì)序列平均長(zhǎng)度分別為962 bp 和320 aa，蛋白質(zhì)分子量大小介于20.5 ～56.5 kD 之間，平均分子量為35.3 kD，理論等電點(diǎn)介于4.36（PtBBX21）～7.05（PtBBX10）之間，平均等電點(diǎn)為5.69，其中7 個(gè)（96.43%）蛋白質(zhì)的pI ＜ 7，表明PtBBXs 蛋白質(zhì)多數(shù)呈酸性（表1）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，所有的PtBBXs成員均位于細(xì)胞核中。

表1 毛果楊BBX 基因家族成員的序列特征Table 1 Sequence characteristics of the BBX gene family members in Populus trichocarpa

2.2 毛果楊BBX 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類(lèi)

為了解BBX家族基因成員在毛果楊與擬南芥之間的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 6.0 軟件，構(gòu)建了毛果楊和擬南芥BBX 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。

圖1 毛果楊和擬南芥BBX 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of BBX genes in P.trichocarpa and Arabidopsis thaliana

基于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，將所有BBX 蛋白序列分為5 組，每個(gè)分組中都包含了毛果楊和擬南芥的BBX成員。Group E 中成員最多，包含12 個(gè)毛果楊和8 個(gè)擬南芥BBX基因。Group A 與Group B 中的家族成員都最少，為7 個(gè)，而Group C 和D 都包含13 個(gè)BBX基因家族成員。

2.3 毛果楊BBX 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

為了明確PtBBX基因家族結(jié)構(gòu)的演變，對(duì)PtBBX家族成員的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行了分析。由圖2 可知，PtBBXs家族基因成員都不包含5’-UTR和3’-UTR，它們的內(nèi)含子數(shù)量從1 到5 個(gè)不等，其中Group A、B 和D 中的基因所包含的內(nèi)含子數(shù)量最少(均只有1 個(gè))。總體看來(lái)，相同分組中PtBBX成員的外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相似，且內(nèi)含子數(shù)量差異較小，而不同分組之間外顯子分布特點(diǎn)和內(nèi)含子數(shù)量的差異較大。保守基序（Motif）也具有類(lèi)似的規(guī)律，即同一分組中的PtBBX 蛋白具有相似類(lèi)型和數(shù)量Motifs（圖2）。

圖2 PtBBX 基因家族成員間的進(jìn)化關(guān)系（A）保守基序（B）和基因結(jié)構(gòu)（C）分析Fig.2 Evolutionary relationships (A), conserved motifs (B) and gene structures (C) between the PtBBXs members

2.4 毛果楊BBX 家族基因啟動(dòng)子序列分析

對(duì)毛果楊28 個(gè)BBX基因家族成員的1 500 bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明除了光響應(yīng)元件外，每個(gè)PtBBX家族基因的啟動(dòng)子序列中都包含大量與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸（Abscisic acid,ABA）、乙烯（Ethylene）、水楊酸（Salicylic acid,SA）和茉莉酸（Jasmonic acid,JA）等信號(hào)響應(yīng)元件以及干旱、低溫響應(yīng)脅迫調(diào)控元件。此外，調(diào)控胚乳生長(zhǎng)，細(xì)胞周期和晝夜節(jié)律等順式作用元件也存在毛果楊BBX家族基因的啟動(dòng)子序列中。綜上說(shuō)明，PtBBX家族基因在逆境脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用（圖3）。

2.5 毛果楊BBX 家族基因的染色體定位及加倍事件分析

根據(jù)毛果楊基因組的注釋文件，將PtBBXs基因在染色體上的分布可視化。由圖4 可知，除PtBBX27和PtBBX28基因沒(méi)有定位到染色體上，其余25 個(gè)PtBBXs基因不均勻地分布在毛果楊的15 條染色體上。其中1 號(hào)染色體上最多，有4 個(gè)PtBBXs基因，而8、10、11、13、14、15 和18 號(hào)染色體都分別僅含有1 個(gè)PtBBX基因。在PtBBXs家族基因中，有21 個(gè)PtBBXs基因之間具有共線性，存在20對(duì)由片段復(fù)制形成的基因?qū)?，說(shuō)明在毛果楊基因組的進(jìn)化過(guò)程中，全基因組加倍事件是PtBBXs家族基因數(shù)量擴(kuò)增的主要方式（圖5）。此外，PtBBXs基因家族成員在毛果楊與擬南芥基因組之間也具有較多的共線性關(guān)系（圖6）。

圖4 毛果楊BBX 基因家族各成員的染色體定位圖Fig.4 Distribution of BBX genes in chromosomes of the P.trichocarpa

圖5 毛果楊BBX 基因家族成員的共線性分析Fig.5 Co-linearity analysis of the BBX family genes in P.trichocarpa

圖6 毛果楊與擬南芥之間BBX 基因家族成員的同源性分析Fig.6 Homology analysis of BBX genes between P.trichocarpa and A.thaliana

2.6 毛果楊BBX 家族基因的組織表達(dá)模式分析

整體上，毛果楊BBX基因家族成員在幼嫩葉片和成熟葉片中都具有較高的表達(dá)水平（圖7）。

圖7 毛果楊BBX 基因家族成員在不同組織中的表達(dá)模式分析Fig.7 The expression patterns of BBX genes in different tissues of P.trichocarpa

此外，PtBBXs基因表達(dá)具有組織特異性。例如，PtBBX5和PtBBX11基因在根中具有較高的表達(dá)水平，推測(cè)它們與根的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)；而PtBBX12和PtBBX28基因在雄性花序和雌性花序中都高表達(dá)，說(shuō)明它們調(diào)控花絮的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能具有重要作用。然而，同一分組中，不同PtBBXs基因具有不同的表達(dá)模式，說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中，它們的功能可能出現(xiàn)不同程度的分化。

2.7 毛果楊BBX 家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

在非生物脅迫下，不同組別（Group）的毛果楊BBX 家族基因的響應(yīng)模式存在差異。例如，在茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）脅迫12 和24 h 后，Group A (PtBBX21、PtBBX4）和Group D (PtBBX26、PtBBX12)具有較高的表達(dá)水平，而其他分組中的大部分PtBBXs基因都只響應(yīng)短時(shí)間內(nèi)的激素脅迫。同樣，Group A (PtBBX21、PtBBX4)，Group D (PtBBX13、PtBBX25)，Group E (PtBBX15、PtBBX24) 響應(yīng)低溫 脅 迫；Group B(PtBBX16、PtBBX19) 和Group C(PtBBX1、PtBBX2)基因同時(shí)響應(yīng)鹽和干旱脅迫；除Group C，其他分組中的PtBBXs基因都在高溫脅迫下具有較高的表達(dá)水平（圖8）。綜上所述，毛果楊BBX家族響應(yīng)了多種非生物脅迫，并可能參與了植物的抗逆過(guò)程。

圖8 毛果楊BBX 家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)譜Fig.8 Expression profiles of BBX genes in P.trichocarpa under abiotic stress

3 討論與結(jié)論

BBX基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。目前，BBX基因家族成員已在多個(gè)物種中被鑒定，例如擬南芥（32 個(gè)）［2］、小麥（87 個(gè)）［20］和香蕉（38 個(gè)）［21］，其數(shù)量在種間具有差異性，這可能與物種基因組的大小以及進(jìn)化過(guò)程中的古多倍化事件有關(guān)［22］。

本研究在毛果楊基因組中鑒定出28 個(gè)PtBBX基因，它們?cè)诰幋a序列長(zhǎng)度，分子量大小以及等電點(diǎn)等方面存在明顯差異。例如，PtBBX家族基因編碼的氨基酸數(shù)量介于184 ～514 個(gè)之間；蛋白質(zhì)分子量大小介于20.5 ～56.5 kD 之間，說(shuō)明毛果楊BBX基因家族成員之間具有多樣性，這也與香蕉［21］和馬鈴薯［23］等物種中BBX基因家族成員的理化特性相似，表明BBX家族成員的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在不同物種間較為保守。

在擬南芥中，BBX基因家族根據(jù)B-box 結(jié)構(gòu)域以及C 端是否含有CCT 結(jié)構(gòu)域被分為5 個(gè)亞族［2］。同樣，毛果楊BBX家族基因成員也被分為5 組，這也與大多數(shù)植物中所描述的BBX基因家族成員的分類(lèi)一致［2,24-25］，再一次說(shuō)明BBX家族成員的基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程中具有較強(qiáng)的保守性。相同分組中PtBBXs基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以及相同類(lèi)型的Motif 類(lèi)型。不同分組之間的BBX家族基因成員都包含1 ～2 個(gè)Motif 1，其對(duì)應(yīng)于B-box 結(jié)構(gòu)域，而Motif 2 則對(duì)應(yīng)于CCT 結(jié)構(gòu)域。有些Motif特異性存在某一分組中，如Motif 6 和Motif 9 等，說(shuō)明不同亞族間的PtBBX基因在功能和進(jìn)化上具有一定的差異。

基因加倍事件對(duì)于基因進(jìn)化至關(guān)重要的，有利于家族基因數(shù)量的擴(kuò)增［26］。在毛果楊基因組中，從定位到染色體上的26 個(gè)BBX基因中發(fā)現(xiàn)有21 個(gè)基因之間存在共線性關(guān)系，形成了20 對(duì)由片段復(fù)制形成的基因?qū)?，說(shuō)明片段加倍事件是毛果楊BBX基因家族形成的主要原因，這與大豆［27］、小麥［19］和玉米［28］中的研究結(jié)果一致，表明不同物種中BBX基因家族具有相同的形成機(jī)制。毛果楊與擬南芥基因組之間的共線性分析表明，毛果楊PtBBX基因家族成員與擬南芥之間存在34 對(duì)直系同源基因?qū)?，推測(cè)它們可能具有相同的生物學(xué)功能。

BBX基因的功能多樣性已在不同物種中得到研究，包括在植物光形態(tài)發(fā)生、生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝以及對(duì)生物或非生物脅迫的反應(yīng)中的作用［29］。例如擬南芥AtBBX21、AtBBX22和AtBBX25基因都參與了光形態(tài)建成［30］。蘋(píng)果中MdBBX37基因通過(guò)光信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)控花青素的積累［31］。SlBBX17基因是正調(diào)控西紅柿的耐熱性［32］。首先，毛果楊BBX家族基因的表達(dá)具有組織特異性。例如，PtBBX5和PtBBX11基因僅根部的具有較高的表達(dá)水平，它們可能在根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用；而PtBBX28和PtBBX12在除韌皮部的其他組織和器官中都高水平表達(dá)，說(shuō)明不同PtBBXs基因的功能在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了不同程度的分化。此外，毛果楊BBX基因家族成員的功能也具有多樣性。在JA、SA、鹽堿、干旱、高溫和低溫脅迫下，毛果楊BBX基因家族成員都具有不同程度的響應(yīng)模式。綜上，毛果楊BBX家族基因在植株生長(zhǎng)和響應(yīng)非生物脅迫中廣泛參與，充分說(shuō)明了它們?cè)谡{(diào)控植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)以及抵御多種非生物脅迫過(guò)程中的重要性。此結(jié)果為進(jìn)一步解析毛果楊BBX 家族基因的功能和楊樹(shù)的抗性改良奠定了基礎(chǔ)。