高青青，李浩彤，霍靜蕾，王彤萱，王 凱，霍靜倩，張金林

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071000）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病原菌微生物制約農(nóng)作物的生產(chǎn)安全［1］，植物病原真菌嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。殺菌劑的應(yīng)用是控制由植物病原真菌引起的植物病害和保障農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的重要手段，然而在生產(chǎn)中殺菌劑的不合理使用容易產(chǎn)生藥害，且易導(dǎo)致植物病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性［2］。近年來(lái)，隨著殺菌劑的抗藥性問(wèn)題日益突出，發(fā)現(xiàn)具有新型結(jié)構(gòu)骨架殺菌化合物和新型殺菌劑作用靶標(biāo)具有重要意義。吲哚作為典型的雜環(huán)天然產(chǎn)物骨架之一，其在自然界中扮演重要的角色［3］，憑借其活性高、種類(lèi)多等特點(diǎn)在日常生活中應(yīng)用廣泛，例如在農(nóng)藥［4］、醫(yī)藥［5］、化工染料［6］等領(lǐng)域均有所研究。在醫(yī)藥領(lǐng)域，吲哚類(lèi)化合物可以對(duì)肺癌具有抑制作用［7］，而且對(duì)哮喘［8］、肥胖癥［9］、心腦血管和神經(jīng)系列疾病具有治療作用［10］，代表藥物有吲哚美辛［11］、褪黑素［12］、利血平［13］等。同時(shí)，吲哚類(lèi)化合物在農(nóng)用化學(xué)品上也有應(yīng)用，例如吲哚乙酸、吲哚丁酸作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物生長(zhǎng)及水果蔬菜的儲(chǔ)藏［14］。吲哚-3-乙酸（植物生長(zhǎng)素）［15］被認(rèn)為是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要激素之一。它可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的很多代謝過(guò)程，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要促進(jìn)作用。此外，吲哚類(lèi)化合物在除草活性方面具有優(yōu)良的效果，開(kāi)發(fā)了一系列新型吲哚-3-羧酸衍生物，并測(cè)定了其除草活性［16］。含有吲哚結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物蘆竹堿具有很強(qiáng)的雜草抑制活性和抗植物病毒活性［17］。王雪莉等人［18］報(bào)道了雙吲哚甲烷類(lèi)化合物對(duì)植物病原菌如油菜菌核病菌和黃瓜灰霉病菌具有抑制作用，結(jié)果表明在質(zhì)量濃度為10 μg/mL 條件下對(duì)油菜菌核病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率分別為61.1%和60.8%。然而目前還沒(méi)有商品化的吲哚類(lèi)殺菌劑，使得開(kāi)發(fā)一種新型吲哚類(lèi)殺菌劑成為可能。

本實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)了一種新型高效“一鍋法”合成2-芳基吲哚的方法［19］。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，利用“一鍋法”合成了6 個(gè)2-芳基吲哚類(lèi)化合物3a-3f，并采用生長(zhǎng)速率法［20］對(duì)所得化合物進(jìn)行殺菌活性評(píng)價(jià)，將殺菌效果較好的化合物進(jìn)一步進(jìn)行活體試驗(yàn)，以期得到具有優(yōu)良?xì)⒕钚缘幕衔?，為開(kāi)發(fā)新型殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用Bruker 500 進(jìn)行核磁共振1H NMR 的測(cè)定，溶劑使用氘代氯仿(CDCl3)。利用Thermo Q Exactive Focus 進(jìn)行化合物高分辨率質(zhì)譜的測(cè)定；X-4雙目顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(河南鞏義高科儀器有限責(zé)任公司)測(cè)定化合物的熔點(diǎn)。

所有化學(xué)反應(yīng)均在干燥的手套箱內(nèi)進(jìn)行。無(wú)水環(huán)戊基甲醚(CPME) 購(gòu)自J&K，未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。其他使用的試劑化學(xué)品購(gòu)自安耐吉試劑公司、阿拉丁試劑公司或畢得醫(yī)藥，未經(jīng)純化直接使用。殺菌活性測(cè)定供試菌種為小麥赤霉病菌(F.g:Fusarium graminearum)、立枯絲核菌(R.s:Rhizoctonia solani)、禾谷絲核菌(R.c:Rhizoctonia cerealis)、茄子枯萎病菌(F.o:Fusarium oxysporum)、瓜果腐霉菌(P.a:Pythium aphanidermatum)、 玉米穗腐菌(F.v:Fusarium verticillioides)、黃瓜灰霉菌(B.c:Botrytis cinerea)、花生褐斑菌(C.a:Cercospora arachidicola)、蘋(píng)果輪紋菌(P.p:Physalospora piricola)、番茄早疫菌(A.s:Alternaria solani)、油菜菌核菌(S.s:Sclerotinia sclerotiorum)均保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系。供試黃瓜品種為：‘新泰密刺’。

1.2 合成方法

參考文獻(xiàn)［19］的合成方法，制備目標(biāo)化合物3a-3f，合成路線如圖1 所示。首先進(jìn)行化合物1a的合成，取100 mL 圓底燒瓶，稱取苯酚1.68 g(18 mmol)， 加入5 mL 的DMF， 稱取4 g(30 mmol)K2CO3加入反應(yīng)瓶中攪拌10 min，再加入2-氟溴芐2.85 g(15 mmol)，再次加入15 mL DMF，55 ℃過(guò)夜攪拌。將反應(yīng)液倒入分液漏斗，加入乙酸乙酯和大量飽和食鹽水，振蕩分層取有機(jī)相，如此重復(fù)3 次，收集有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4干燥，減壓除去溶劑，將產(chǎn)物分離純化，洗脫劑用純石油醚，用1H NMR(500 MHz)和HRMS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthesis route of the target compounds

化合物3a-3f 的合成：該反應(yīng)在干燥的手套箱內(nèi)進(jìn)行，以化合物1a 合成為例，取1 個(gè)微波管，放入轉(zhuǎn)子，稱取100.4 mg(0.6 mmol)的LiN(SiMe3)2和60.8 mg(0.4 mmol) CsF，再量取1a 97.06 mg(0.48 mmol) 和2- 甲基苯甲醛24.03 mg(0.2 mmol)，加入溶劑環(huán)戊基甲基醚CPME 1.0 mL，蓋上塞子捏緊，從手套箱取出后110 ℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)完畢后加2 滴水淬滅，再加入乙酸乙酯，得到的粗產(chǎn)物用100 ～200 目的硅膠進(jìn)行分離純化，洗脫液V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=50 ∶1，制備目標(biāo)化合物3a-3f，并且均進(jìn)行1H NMR (500 MHz)和HRMS 的結(jié)構(gòu)表征。

1.3 離體殺菌活性的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定合成的6 種吲哚類(lèi)衍生物對(duì)11 種植物病原菌的殺菌活性。具體操作如下：將每種測(cè)試化合物(20.0 mg)溶于適量的N，N-二甲基甲酰胺(0.1 mL)，并用含有0.1%吐溫80 的水定容至20.0 mL 制備成待測(cè)化合物溶液。向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1 mL 測(cè)試溶液和9 mL PDA 培養(yǎng)基，制成100 μg/mL 濃度的帶藥培養(yǎng)基，以不含藥劑的無(wú)菌水為空白對(duì)照。三唑酮、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、啶酰菌胺、氟唑菌酰胺和氰稀菌酯為陽(yáng)性對(duì)照藥劑。每個(gè)處理做3 次重復(fù)。把接種后的培養(yǎng)皿倒放在培養(yǎng)箱24 ℃內(nèi)，72 h 之后用十字交叉法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)的直徑，并按以下公式計(jì)算抑制率，采用 Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性比較。

對(duì)于初篩效果較好的目標(biāo)化合物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)總€(gè)目標(biāo)化合物設(shè)置7 個(gè)濃度，以不含藥劑的空白溶液作為空白對(duì)照，以苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。按上述方法分別計(jì)算各藥劑對(duì)應(yīng)抑制率，使用SPSS 軟件對(duì)藥劑系列濃度與抑制率之間的關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，求出對(duì)應(yīng)化合物的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2，求出每種化合物有效抑制中濃度(EC50值)。

1.4 溫室盆栽法測(cè)定活體殺菌活性

選用對(duì)灰霉病易感的黃瓜品種‘新泰密刺’種子，消毒后將種子置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的露白的種子移植至塑料盆中生長(zhǎng)，每盆種植1 株，每個(gè)處理設(shè)3 盆重復(fù)，待黃瓜長(zhǎng)至三片葉時(shí)備用。稱取待測(cè)化合物5 mg，溶于150 μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入吐溫80 的蒸餾水定容至5 mL，制成1 000 μg/mL 濃度的母液。再用吐溫80 水將農(nóng)藥母液稀釋成100 μg/mL 的供試濃度，以不含藥劑的吐溫80 水為空白對(duì)照，以啶酰菌胺和苯醚甲環(huán)唑?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，使用手動(dòng)按壓噴霧瓶進(jìn)行統(tǒng)一噴藥處理，將各個(gè)化合物待測(cè)藥液均勻噴灑至花盆中3 株三葉期的黃瓜葉片上，噴藥后自然晾曬24 h 后，將培養(yǎng)好的供試菌落制成菌餅，將菌餅帶菌面朝下接種于黃瓜葉片上，每個(gè)葉片接種1 個(gè)菌餅，做3 個(gè)重復(fù)。接種后在溫室中培養(yǎng)，7 d 后調(diào)查結(jié)果，通過(guò)與空白對(duì)照病斑面積相比，計(jì)算出每個(gè)藥劑濃度對(duì)病害控制百分比，以100 級(jí)代表無(wú)病，即抑制率100%；0 級(jí)代表最嚴(yán)重的發(fā)病程度，即抑制率為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的合成

采用“一鍋法”合成制備了6 個(gè)新型2-芳基吲哚類(lèi)化合物，具體目標(biāo)化合物的氫譜、高分辨質(zhì)譜及物理性狀結(jié)果如下：

化合物3a，黃色固體，產(chǎn)率55.8%, m.p.: 96 ～97 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.19 (s, 1H),7.69 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.54 - 7.48 (m, 1H), 7.44(d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.36 - 7.30 (m, 3H), 7.24 (t, J= 7.3 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.65 (d, J =2.2 Hz, 1H), 2.54 (s, 3H).HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C15H13N：207.1048,found：208.1120。

化合物3b，白色固體，產(chǎn)率86.8%, m.p.:82 ～83 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.30 (s, 1H),7.62 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 - 7.30 (m, 2H), 7.24- 7.19 (m, 2H), 7.18 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.11 (t, J =7.4 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.2, 2.2 Hz, 1H), 6.81 (s,1H), 3.85 (s, 3H).HRMS (ESI)［M+H］+calcd for C15H13NO：223.0997,found：224.1068。

化合物3c，黃色固體，產(chǎn)率78.0%, m.p.:82 ～83 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.67 (s, 1H),7.86 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.43(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.19 (t, J= 7.2 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.10 - 7.02 (m,2H), 6.92 (s, 1H), 4.03 (s, 3H).HRMS (ESI)［M+H］+calcd for C15H13NO：223.0997,found：224.1068。

化合物3d，白色固體，產(chǎn)率54.3%, m.p.:88 ～89 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.33 (s, 1H),7.87 (s, 1H), 7.80 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.64 (d, J =7.9 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.24 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 7.4 Hz,1H), 6.89 (s, 1H).HRMS (ESI)［M+H］+calcd for C15H10F3N：261.0765,found：262.0836。

化合物3e，白色固體，產(chǎn)率86.6%, m.p.:91 ～92 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.67 (s, 1H), 7.86(d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.43(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.33 - 7.27 (m, 1H), 7.19 (t, J =8.2 Hz, 1H), 7.15 - 7.02 (m, 3H), 6.92 (s, 1H), 4.03(s, 3H).HRMS (ESI)［M+H］+calcd for C15H13N：207.1048,found：208.1121。

化合物3f，白色固體，產(chǎn)率65.2%, m.p.:87 ～88 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.33 (s, 1H),7.82 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.71 - 7.65 (m, 2H), 7.62 (t,J = 7.5 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J =8.1 Hz, 1H), 7.29 - 7.22 (m, 2H), 7.17 (t, J = 7.5 Hz,1H), 6.72 (s, 1H).HRMS (ESI) ［M+H］+calcd for C15H10F3N：261.0765,found：262.083。

表1 化合物3a-3f 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 The structure of target compounds 3a-3f

2.2 目標(biāo)化合物離體殺菌活性測(cè)定結(jié)果

為了測(cè)定所合成化合物的殺菌生物活性，對(duì)目標(biāo)分子的離體殺菌活性進(jìn)行篩選研究。殺菌活性結(jié)果如表2 所示。在100 mg/L 濃度下，化合物3a 對(duì)立枯絲核菌的抑制率為80.3%，顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥劑啶酰菌胺（P＜0.05）?；衔?a 和3f 對(duì)禾谷絲核菌的抑制率分別為86.7%和79.6%，顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥劑三唑酮、氰烯菌酯和啶酰菌胺（P＜0.05）?；衔?a、3e 和3f 對(duì)黃瓜灰霉病的抑制率分別為84.7%、85.1%和87.8%，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥劑氰烯菌酯和啶酰菌胺（P＜0.05）。為了進(jìn)一步評(píng)估目標(biāo)化合物的殺菌潛力，將化合物在100 mg/L濃度下，初篩結(jié)果較好的化合物3a、3e 和3f 進(jìn)行了抑制中濃度EC50的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表3 所示。化合物3a 對(duì)禾谷絲核菌表現(xiàn)優(yōu)異的殺菌活性，EC50值為3.290 μg/mL，優(yōu)于對(duì)照藥劑吡唑醚菌酯(4.593 μg/mL)?；衔?a 和3f 對(duì)黃瓜灰霉病菌表現(xiàn)出較好的抑制活性，EC50值分別為7.408 和9.662 μg/mL，與對(duì)照藥劑苯醚甲環(huán)唑(4.225 μg/mL)和吡唑醚菌酯(4.168 μg/mL)效果相當(dāng)。

表2 化合物3a-3f 的殺菌活性(100 mg/L，菌絲生長(zhǎng)速率法，抑制率%)Table 2 In vitro fungicidal activity of compounds 3a-3f (100 mg/L, growth rate method, inhibition rate%)

表3 目標(biāo)化合物的EC50 測(cè)定結(jié)果Table 3 The EC50 values of target compounds

2.3 目標(biāo)化合物活體殺菌活性測(cè)定

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物的活體殺菌活性，選擇化合物3a、3e 和3f，測(cè)定了其對(duì)黃瓜灰霉病的保護(hù)活性，結(jié)果如表4 所示：空白處理的黃瓜葉片感染嚴(yán)重，化合物3a 在100 μg/mL 時(shí)對(duì)黃瓜灰霉病表現(xiàn)出良好的保護(hù)活性，與啶酰菌胺和苯醚甲環(huán)唑效果相當(dāng)，化合物3e 和3f 對(duì)黃瓜灰霉病也表現(xiàn)出較好的保護(hù)活性。上述結(jié)果表明，2-芳基吲哚類(lèi)化合物具有良好的抗菌活性，其可以作為潛在的活性化合物骨架，為開(kāi)發(fā)新型殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

表4 目標(biāo)化合物對(duì)黃瓜灰霉病菌的活體保護(hù)活性Table 4 In vivo protective activity of target compounds against B.cinerea on cucumber

3 結(jié)論與討論

目前有關(guān)吲哚類(lèi)化合物的合成方法有很多，傳統(tǒng)的Bischler［21］合成方法和Fischer［22］合成方法需要苛刻的反應(yīng)條件，并且會(huì)用到危險(xiǎn)性化學(xué)品肼?，F(xiàn)在許多吲哚合成的方法用到過(guò)渡金屬來(lái)作為催化劑提高反應(yīng)效率［23-24］，然而活性藥物對(duì)微量重金屬污染物含量具有限制，因此開(kāi)發(fā)使用一種綠色環(huán)保的吲哚類(lèi)化合物合成方法具有重要意義。此外，化合物合成方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全、綠色環(huán)保是目前農(nóng)藥生產(chǎn)中最重要的考慮因素，同時(shí)也是高活性化合物能否實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵所在，因此，基于綠色合成方法進(jìn)行新農(nóng)藥的創(chuàng)制至關(guān)重要。本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以2-氟溴芐、苯酚、LiN(SiMe3)2和CsF 等商品化合物為原料，以環(huán)戊己甲基醚為溶劑，在反應(yīng)溫度為110 ℃的條件下，采用“一鍋法”合成方法，設(shè)計(jì)并合成了6 個(gè)2-芳基吲哚類(lèi)衍生物。該方法簡(jiǎn)化了反應(yīng)操作過(guò)程，保證了反應(yīng)的安全性，且容易規(guī)?；?，避免了使用昂貴試劑和苛刻反應(yīng)條件。

2-芳基吲哚是具有廣泛生物活性的優(yōu)越分子骨架［25］，目前，有關(guān)2-芳基吲哚類(lèi)化合物的殺菌活性鮮見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究選取了11 種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的植物病原真菌，對(duì)本研究中合成得到6 種2-芳基吲哚類(lèi)化合物的進(jìn)行了離體殺菌活性評(píng)價(jià)，并在初篩的基礎(chǔ)上進(jìn)行黃瓜灰霉病活體殺菌活性測(cè)定。殺菌活性結(jié)果顯示，所合成的化合物表現(xiàn)出不同的殺菌活性，其中2-芳基吲哚類(lèi)化合物中鄰位取代基為-CH3時(shí)（化合物3a）的殺菌活性優(yōu)于間位取代基-CH3（化合物3e），鄰位取代基為-CF3時(shí)（化合物3f）的殺菌活性優(yōu)于間位取代基-CF3（化合物3d），當(dāng)取代基為-OCH3時(shí)的化合物殺菌活性均較低。綜上所述，不同的取代基及取代基位置不同均會(huì)影響化合物的殺菌活性?；铙w殺菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，化合物3a 表現(xiàn)出與商品化殺菌劑相當(dāng)?shù)幕钚?，其可以作為潛在的活性化合物或骨架，為進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)新的殺菌劑提供基礎(chǔ)。本研究不僅為新型殺菌劑創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)，且對(duì)發(fā)現(xiàn)新型殺菌化合物作用靶標(biāo)具有一定的推動(dòng)作用。