陽辛鳳　梅文莉　李薇　龐朝海　董文化　潘永波　張群

關(guān)鍵詞：沉香；2-（2-苯乙基）色酮聚合物；超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：Q949.761.1；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

沉香（ agarwood ） 是由瑞香科沉香屬（Aquilaria spp.）植物木質(zhì)部組織及其分泌物共同組成的木材[1-3]，主要分布于印度尼西亞、馬來西亞、越南、柬埔寨、中國(guó)等國(guó)家[3-5]。沉香是一種珍稀藥材，具有安神鎮(zhèn)靜、消炎止痛、抗菌、抗氧化、抗心肌缺血、抗腫瘤等功效[3， 6-9]。2-（2-苯乙基）色酮聚合物（PPECs）是與沉香藥理活性密切相關(guān)的一類重要生物活性物質(zhì)[3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，PPECs 分為3 類，由2 個(gè)或3 個(gè)2-（2-苯乙基）色酮單元結(jié)合形成的2-（2-苯乙基）色酮二聚物（DPECs）和2-（2-苯乙基）色酮三聚物（TPECs），以及由萜類與2-（2-苯乙基）色酮單元結(jié)合形成的萜類-2-（2-苯乙基）色酮二聚物（SPECs）[3-5]。在已有報(bào)道中，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是對(duì)沉香中化學(xué)成分進(jìn)行分析的主要方法，廣泛用于萜類為主的眾多揮發(fā)性成分和低分子量2-（2-苯乙基）色酮類成分的鑒定[10-16]。然而沉香中PPECs 分子量較大，沸點(diǎn)高， 不適于氣質(zhì)聯(lián)用分析。目前對(duì)沉香PPECs 的分析多沿用傳統(tǒng)的先分離純化后結(jié)構(gòu)鑒定方式[17-20]。據(jù)報(bào)道，從不同產(chǎn)地、不同品種沉香中分離鑒定的2-（2-苯乙基）色酮類成分約250個(gè)，其中PPECs 約100 個(gè)[3-5]。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS/MS）開始應(yīng)用于沉香中色酮類成分的鑒定，鑒定了AH12、AH13、AH15、AH21、methoxyAH21、dehydroxy AH21 等PPECs[5， 21-23]。PPECs不僅具有生物活性，而且多樣性豐富，是沉香產(chǎn)地鑒定、結(jié)香方式鑒別的重要標(biāo)志性成分[5， 21-23]，因此有必要深入挖掘沉香PPECs 分子資源。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)沉香PPECs 成分進(jìn)行鑒定，有助于深入了解沉香藥材的藥物組成，為沉香藥材的現(xiàn)代化與標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 沉香對(duì)照藥材購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試劑 乙腈（色譜純），購自德國(guó)默克公司；甲酸（色譜純），購自美國(guó)Fisher 公司。超純水為Milli-Q 系統(tǒng)純化水，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀：Triple TOF 5600+型，安裝有Analyst?TF 1.6 工作站、PeakView? 2.0 軟件，美國(guó)ABSCIEX 公司；電子天平：ME204 型，感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；電子天平：JJ500 型，感量0.01 g，江蘇常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 提取 稱取沉香對(duì)照藥材粉末0.50 g，置于50 mL 具塞三角瓶中，加入甲醇10 mL，稱重，浸泡0.5 h，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）1 h，冷卻，再次稱重，滴加甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，于10 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)分析。

1.2.2 儀器參數(shù) 液相色譜儀器參數(shù)：WatersAtlantis T3 色譜柱（2.1 mm×50 mm， 3.0 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～5 min，5%～15% B；5～10 min，15%～20% B；10～28 min，20%～25% B；28～50 min，25%～35% B；50～60 min，35%～40% B；60～80 min，40%～90% B；80～87 min，90% B；87～88 min ， 90%～5% B； 88～90 min ，5% B ； 流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

飛行時(shí)間質(zhì)譜儀儀器參數(shù)：ESI 離子源，電噴霧正離子模式，離子源電壓5500 V，離子源溫度550 ℃，霧化氣55 psi，輔助氣55 psi，氣簾氣35 psi，去簇電壓100 V，碰撞能量35 eV，能量擴(kuò)展±15 eV，TOF-MS 掃描范圍50～1200 Da，Product Ion 掃描范圍50～1000 Da。掃描方式為IDA 模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采取靶向檢索與非靶向檢索相結(jié)合策略。

靶向檢索：通過查詢文獻(xiàn)，建立PPECs 組分列表，包括英文名稱、CAS 號(hào)、分子結(jié)構(gòu)式、分子量、二級(jí)碎片離子質(zhì)荷比（m/z）等信息。將樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView 軟件進(jìn)行檢索，依據(jù)測(cè)定的精確質(zhì)量數(shù)與理論的精確質(zhì)量數(shù)的偏差小于5 mmol/L 的原則以及同位素分布模式，確定各色譜峰的成分歸屬，根據(jù)二級(jí)碎片離子信息推斷各色譜峰所對(duì)應(yīng)未知物的結(jié)構(gòu)，并與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)從而進(jìn)一步確證結(jié)構(gòu)。

非靶向檢索：樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView 軟件進(jìn)行非靶向檢索，如果色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)與同位素偏差均小于5 mmol/L，母離子m/z 大于400，碎裂反應(yīng)時(shí)以脫水、脫羰基等中性丟失為主要形式，且二級(jí)碎片離子中具有m/z 為91、107、121、137、164、192、227、239、255、267、283、301等特征離子，則初步判定該未知物屬于PPECs。采用Formula Finder 程序推測(cè)未知物分子式，并基于PPECs 的質(zhì)譜裂解規(guī)律以及二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，推斷PPECs 中2-（2-苯乙基）色酮結(jié)構(gòu)單元的類型和結(jié)合方式，以及取代基類型與位置，初步確定PPECs 的結(jié)構(gòu)。繪制PPECs 結(jié)構(gòu)式并將其導(dǎo)入PeakView 軟件，通過Frangment Pane 程序計(jì)算理論二級(jí)碎片與實(shí)際二級(jí)碎片之間的匹配度，從而確定PPECs 結(jié)構(gòu)，并與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)從而進(jìn)一步確證結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPECs 鑒定結(jié)果

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析沉香PPECs，在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，獲得各未知物的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰及MS/MS 碎片離子的精確相對(duì)分子質(zhì)量。共鑒定出PPECs 成分55 個(gè)，其中44 個(gè)DPECs、3 個(gè)TPECs 和8 個(gè)SPECs。DPECs 組分最為豐富，在總PPECs 中所占比例最高，達(dá)到80%；其次是SPECs（14.5%）；TPECs 組分最少，僅為5.5%。相關(guān)成分的質(zhì)譜信息列于表1，結(jié)構(gòu)見圖1～圖3。

2.2 質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

2.2.1 色酮二聚物（DPECs） 沉香樣品中共鑒定出44 個(gè)DPECs 成分，分別是化合物1～17、19～31、33、35、36、40～47 和48～50（表1，圖1）。圖1 表明，DPECs 的結(jié)構(gòu)單元之間的連接方式具有差異性，根據(jù)2-（2-苯乙基）色酮單元之間連接方式的不同，44 個(gè)DPECs 成分分為4 種類型，A 型DPECs 的結(jié)構(gòu)單元之間通過C-C 鍵相連，如化合物50；B 型DPECs 結(jié)構(gòu)單元之間通過C-O-C 鍵相連，如化合物1、2、3、6、7 等；C 型DPECs 結(jié)構(gòu)單元之間通過2 個(gè)C-O-C 鍵相連，如化合物3、4、5、36 等；D 型DPECs 其結(jié)構(gòu)單元之間通過C-C 鍵和C-O-C 鍵相連，如化合物28、42、44～46。

DPECs 的質(zhì)譜裂解具有較強(qiáng)的規(guī)律性，如常見的有脫水（[M+H-18]）、脫羧（[M+H-44]）、脫羰基（[M+H-28]+）、碳碳鍵（C-C）斷裂等[5， 11， 17]，這些規(guī)律是對(duì)DPECs 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的重要依據(jù)。序號(hào)20、25、27 和41 的色譜峰其母離子具有相同的質(zhì)荷比（m/z）和相同的分子式，鑒定為AH15及其同分異構(gòu)體，它們的二級(jí)質(zhì)譜圖與可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4 和圖5。色譜峰20 母離子（[M+H]）m/z 為583.1986，連續(xù)2 次失去水分子分別產(chǎn)生碎片m/z 565.1865（[M+H-18]）和m/z 547.1758（[M+H-36]），m/z 547.1758 丟失羰基則產(chǎn)生碎片m/z 519.1807（[M+H-36-28]+），m/z519.1807 丟失苯環(huán)則產(chǎn)生碎片m/z 441.1330（[M+H-36-28-78]）。其次，m/z 583.1986 的C-O-C鍵發(fā)生斷裂，斷裂產(chǎn)物隨后發(fā)生脫水反應(yīng)，生成碎片m/z 301.1078，m/z 301.1078 失去一分子水產(chǎn)生碎片m/z 283.0966，m/z 283.0966 脫去一分子羰基生成碎片m/z 255.1008，脫去一分子CO 則生成m/z 239.1049，m/z 283.0966 的色酮環(huán)與苯環(huán)之間C7′、C8′處的C-C 鍵受到電子轟擊而斷裂，生成碎片m/z 192.0398 和m/z 91.0525。根據(jù)以上分析，推測(cè)該未知物是AH15，即沉香四醇與6，7-二羥基-2-（2-苯乙基）色酮通過C-O-C 鍵相連形成的色酮二聚物。

同理，通過對(duì)其他色譜峰二級(jí)碎片等信息進(jìn)行分析，確定了共44 種DPECs 化合物的結(jié)構(gòu)（圖1）。其中9 個(gè)DPECs 化合物尚無文獻(xiàn)報(bào)道，即化合物1、7～11、13、14 和21，是潛在的新化合物。鑒定出分子式相同的一組同分異構(gòu)體，但是無法確定結(jié)構(gòu)中各取代基的空間朝向。

本研究從沉香樣品中鑒定的PPECs 組分普遍具有同分異構(gòu)體，如AH13、AH15 各有4 個(gè)同分異構(gòu)體，AH21、dehydroxy AH21、AH12 等各有2 個(gè)同分異構(gòu)體。據(jù)LI 等[5]報(bào)道，沉香PPECs 同分異構(gòu)體豐富，如，AH15 同分異構(gòu)體多達(dá)13 個(gè)，AH21 同分異構(gòu)體有7 個(gè)，hydroxyl AH11、AH12、AH13 則各有6 個(gè)同分異構(gòu)體。PPECs 結(jié)構(gòu)中含有色酮環(huán)，環(huán)上的氫原子、羥基、甲氧基等取代基的取代位置不同和化學(xué)鍵空間朝向不同是同分異構(gòu)體豐富的主要來源。具有相同分子式的一組同分異構(gòu)體的共同特征是質(zhì)譜二級(jí)碎片大多相同，但保留時(shí)間不同。液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜能鑒定出分子式相同的一組同分異構(gòu)體，但是無法確定結(jié)構(gòu)中各取代基的空間朝向。

2.2.2 色酮三聚物（TPECs） 從沉香樣品中共鑒定出3 個(gè)TPECs 組分，分別是化合物34、38、54（圖1），其中化合物34、38 為同分異構(gòu)體?；衔?4 的二級(jí)質(zhì)譜圖與質(zhì)譜裂解途徑見圖6 和圖7，母離子（[M+H]+）m/z 815.2865，失去一分子水生成碎片m/z 797.3320（[M+H-18]+），化合物54 結(jié)構(gòu)中的C-O-C 鍵發(fā)生斷裂，生成2 個(gè)碎片m/z 267.1019 和m/z 567.2241，m/z 567.2241 脫去一分子水生成碎片m/z 549.1916，m/z 549.1916繼續(xù)脫水產(chǎn)生碎片m/z 531.1816，m/z 531.1816 中的酯鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生m/z 283.0969，m/z 283.0969脫去一分子CO 則生成m/z 239.1065。根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測(cè)化合物54 是由沉香四醇與兩分子5-羥基-2-（2-苯乙基）色酮通過C-O-C 鍵相連形成的色酮三聚物?；衔?4 目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)為新化合物。

2.2.3 萜類-色酮二聚物（SPECs） 總共鑒定出8 個(gè)SPECs 組分，分別是化合物18、32、37、39、51、52、53 和55。4 個(gè)化合物（32、39、51 和52）被鑒定為aquilacrassnin A 及其同分異構(gòu)體?；衔?2 的二級(jí)質(zhì)譜圖與質(zhì)譜裂解途徑見圖8 和圖9。化合物32 母離子（[M+H]）m/z 535.2691，失去一分子水生成碎片m/z 517.2596（[M+H-18]），再失去一分子水生成碎片m/z 499.2468（[M+H-36]）。母離子結(jié)構(gòu)中的酯健發(fā)生斷裂，生成2 個(gè)碎片m/z235.1678 和m/z 319.1194，m/z 319.1194 脫去一分子水生成碎片m/z 301.1054，m/z 301.1054 繼續(xù)脫水產(chǎn)生碎片m/z 283.0957，m/z 283.0957 中脫去苯甲基則生成m/z 192.0397。m/z 235.1678 脫去一分子水生成碎片m/z 217.1574，m/z 217.1574 脫去一分子羰基生成碎片m/z 189.1611。根據(jù)以上分析，推斷化合物32 為aquilacrassnin A，是沉香四醇與芹子-4，11-二烯-14-油酸（selina-4，11-dien-14-oicacid）通過酯鍵相連形成的二聚物。

3 討論

沉香2-（2-苯乙基）色酮類化合物種類豐富，但是同分異構(gòu)體與立體異構(gòu)體眾多，質(zhì)譜規(guī)律呈現(xiàn)出多樣性與復(fù)雜性，質(zhì)譜解析難度大。PPECs 的裂解規(guī)律與2-（2-苯乙基）色酮單元裂解規(guī)律相似，受到電子轟擊時(shí)往往先脫去一分子或多分子水，或脫羰基，然后色酮單元之間的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，生成2～3 個(gè)相應(yīng)的色酮單元或脫水、脫羰基后的色酮單元，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)生碎裂反應(yīng)，例如色酮單元中連接色酮環(huán)和苯環(huán)的C7′、C8′處的C-C 鍵發(fā)生斷裂，形成色酮離子碎片和苯甲基離子碎片，以及色酮環(huán)上發(fā)生進(jìn)一步脫水、脫羰基。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)沉香藥材中PPECs 進(jìn)行分析，探討了PPECs 成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。共鑒定出55 個(gè)PPECs 成分， 包括2-（2- 苯乙基） 色酮二聚物（DPECs）44 個(gè)，三聚物（TPECs）3 個(gè)，萜類-2-（2-苯乙基）色酮二聚物（SPECs）8 個(gè)，其中9 個(gè)DPECs、1 個(gè)TPECs 和1 個(gè)SPECs 首次在沉香中被發(fā)現(xiàn)。其次，沉香PPECs 的部分組分具有2～4個(gè)同分異構(gòu)體。以上結(jié)果表明，沉香藥材中的PPECs 組分及其同分異構(gòu)體豐富，且DPECs 類型的組分在總PPECs 中所占比例最高（80%）。研究結(jié)果為沉香藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，為沉香藥材的現(xiàn)代化與標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。