鄒優(yōu)花，連玲丹，鐘武杰，杜敏如，黃穎茵，王杰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），學(xué)名為刺芹側(cè)耳菌。杏鮑菇因其獨(dú)特的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受人們喜愛(ài)，它富含萜類、甾醇、多糖和多酚等生物活性成分[1]，具備藥用和功能性食品的特性，因此深受歡迎[2]。目前該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到優(yōu)質(zhì)種質(zhì)供應(yīng)不足的制約，成為其發(fā)展的核心難題。隨著市場(chǎng)需求的快速增長(zhǎng)，對(duì)杏鮑菇優(yōu)良種源的需求愈發(fā)緊迫。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)食用菌進(jìn)行定向遺傳改良也成為新品創(chuàng)制的主流方式[3]。目前在茶樹菇[4]、香菇[5]、金針菇[6]等食用菌中已成功利用原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系選育出優(yōu)良品種。原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化是以原生質(zhì)體為基礎(chǔ)[7]，以優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)原生質(zhì)體的制備與再生為前提，以穩(wěn)定有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法為關(guān)鍵步驟。目前食用菌原生質(zhì)體多集中于其制備與再生條件[8]，但劉莉等[9]發(fā)現(xiàn)將制備體系優(yōu)化后所得的原生質(zhì)體用于遺傳轉(zhuǎn)化，卻得到較低轉(zhuǎn)化效率。因此，用于遺傳轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體不僅要有高的產(chǎn)量和再生率，也要具備高轉(zhuǎn)化效率。

本研究以杏鮑菇菌株GIM5.344 為材料，通過(guò)對(duì)裂解酶、酶解溫度、酶解時(shí)間、再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑種類4 個(gè)因素進(jìn)行研究，優(yōu)化杏鮑菇原生質(zhì)體的制備與再生條件。同時(shí)，通過(guò)對(duì)潮霉素濃度篩選和轉(zhuǎn)化方式的優(yōu)化，建立穩(wěn)定有效的杏鮑菇原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為杏鮑菇的菌種改良和優(yōu)良品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌株GIM5.344、質(zhì)粒4：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王杰教授課題組構(gòu)建；溶壁酶1（≥200 U/mg）：廣東省微生物研究所；溶壁酶2（≥200 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（≥200 U/mg）、甘露醇、聚乙二醇4000、氯化鈣、順丁烯二酸、順丁烯二酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈉：上海麥克林生化科技股份有限公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4 恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司；SPX-158L 生化培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；SPH-2102C 恒溫?fù)u床：上海世平搖床廠；JY600C 電泳儀：北京君意東方設(shè)備有限公司；QuantityStudio3 熒光定量PCR 儀、Quantity-Studio3 熒光顯微鏡：美國(guó)Applied Biosystems 公司；SWCJ-1F 超凈工作臺(tái)：江蘇蘇州凈化公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

0.2 mol/L 馬來(lái)酸溶液：0.2 mol/L 順丁烯二酸和0.2 mol/L順丁烯二酸二鈉以1 ∶2 的體積比混合，調(diào)節(jié)pH 值至5.5，121 ℃，滅菌20 min。

甘露醇-馬來(lái)酸（mannitol-maleic acid，MM）緩沖液：0.6 mol/L 甘露醇溶液25 mL，0.2 mol/L 馬來(lái)酸溶液12.5 mL，去離子水12.5 mL，過(guò)濾除菌。

甘露醇-馬來(lái)酸-氯化鈣（mannitol-maleic acid-CaCl2buffer，MMC）緩沖液：0.6 mol/L 甘露醇溶液25 mL，0.2 mol/L 馬來(lái)酸溶液12.5 mL，1 mol/L CaCl2溶液1.25 mL，去離子水11.25 mL，過(guò)濾除菌。

STC 溶液：10.93 g 甘露醇，1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（pH7.5）1 mL，1 mol/L CaCl2溶液2.5 mL，定容至100 mL，121 ℃，滅菌20 min。

1.3.2 原生質(zhì)體的制備

活化培養(yǎng)：用接種鉤將保藏的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接至馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）平板，在28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)6 d。

液體培養(yǎng)：取PDA 平板上長(zhǎng)的新菌絲，將菌絲接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d。

恢復(fù)培養(yǎng)：待液體培養(yǎng)長(zhǎng)出菌絲球后，用均質(zhì)機(jī)將菌絲球打成細(xì)小碎片狀，取5～7 mL 勻漿碎片液體轉(zhuǎn)至100 mL 完全酵母培養(yǎng)基（complete yeast medium，CYM）中，在28 ℃培養(yǎng)箱靜置恢復(fù)4 d（每天手動(dòng)搖勻2 次），等待破碎后的菌絲長(zhǎng)出較嫩的絮狀菌絲即可作為原生質(zhì)體制備的材料。

原生質(zhì)體制備：菌絲過(guò)濾，稱取0.05 g 菌絲加入1 mL 裂解酶，將菌絲彈勻，于32 ℃水浴鍋水浴2.5 h，期間每隔10 min 顛倒混勻1 次，水浴結(jié)束后用塞有棉花的注射器過(guò)濾取得原生質(zhì)體液，2 500 r/min、4 ℃離心20 min 后加500 μL MM 緩沖液和MMC 緩沖液各清洗1 次，最終加100 μL STC 重懸原生質(zhì)體，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。原生質(zhì)體產(chǎn)量的計(jì)算公式如下。

P=C×4×106×N

式中：P 為原生質(zhì)體產(chǎn)量，CFU/mL；C 為血球計(jì)數(shù)板上每個(gè)小方格的原生質(zhì)體數(shù)，CFU/mL；N 為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 不同裂解酶對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

固定酶解溫度為32 ℃、酶解時(shí)間為2.5 h，探究不同裂解酶（溶璧酶1、溶璧酶2、纖維素酶）對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響。

1.3.4 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

按照1.3.2 方法制備原生質(zhì)體，篩選裂解酶，設(shè)置酶解溫度為28、30、32、34、36 ℃，過(guò)濾收集原生質(zhì)體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋到最佳濃度后進(jìn)行再生試驗(yàn)，確定最佳酶解溫度。

1.3.5 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的影響

固定最佳裂解酶為溶壁酶1，酶解溫度為32 ℃，設(shè)置酶解時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，按照1.3.2 的方法制備原生質(zhì)體，分別收集原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)后稀釋至最佳濃度進(jìn)行再生試驗(yàn)。

1.3.6 原生質(zhì)體再生

將原生質(zhì)體稀釋成108CFU/mL，取100 μL 加入0.9 mL 的CYM 再生液體培養(yǎng)基，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)16 h 后2 500 r/min、4 ℃離心20 min，去除上清液留取少量液體重懸原生質(zhì)體后涂板于PDA再生培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～10 d。再生率計(jì)算公式如下。

R=（C1/C2）×100

式中：R 為再生率，%；C1為原生質(zhì)體再生單個(gè)菌落，CFU/mL；C2為原生質(zhì)體個(gè)數(shù)，CFU/mL。

1.3.7 再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑的篩選

固定原生質(zhì)體制備裂解酶為溶壁酶1、酶解時(shí)間為2.5 h、酶解溫度為32 ℃、原生質(zhì)體濃度為108CFU/mL、穩(wěn)滲劑濃度為0.6 mol/L，探究甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈉對(duì)原生質(zhì)體的影響，確定最佳再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑。

1.3.8 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化采用CaCl2-PEG 轉(zhuǎn)化法：杏鮑菇菌絲體32 ℃酶解2.5 h 后過(guò)濾，用1 mL MM 緩沖液在4 ℃、2 500 r/min、20 min 的條件下離心洗滌1 次，再用1 mL MMC 緩沖液同條件離心洗滌1 次，倒掉上清液，加100 μL STC 鏡檢，預(yù)估原生質(zhì)體的數(shù)量，將原生質(zhì)體稀釋至107CFU/mL，每管100 μL 原生質(zhì)體加入10 μL質(zhì)粒4[圖1，帶有潮霉素抗性基因（HygR）和綠色熒光蛋白基因（GFP）]和100 μL PEG 溶液，同時(shí)將不添加質(zhì)粒的設(shè)為空白對(duì)照組，冰浴50 min。然后每管加入500 μL PEG 溶液，混合均勻后，于30 ℃水浴鍋水浴30 min，再加500 μL STC 緩沖液混勻后倒入再生培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

圖1 質(zhì)粒4 圖譜Fig.1 Plasmid 4 diagram

1.3.9 潮霉素濃度的篩選

按照1.3.2 的方法制備出原生質(zhì)體后，將原生質(zhì)體稀釋至106CFU/mL 后吸取100 μL 分別涂布于0、2、4、6、8、10 μg/mL 的再生培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)10 d 后計(jì)數(shù)。

1.3.10 PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化杏鮑菇原生質(zhì)體方法的篩選

PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，按以下4 種方式進(jìn)行培養(yǎng)和篩選擬轉(zhuǎn)化子。

方法1（直接涂布法）：將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體懸液4 ℃、2 500 r/min 離心20 min，除去部分上清液，留取100 μL 原生質(zhì)體懸液，直接涂布于30 μg/mL 潮霉素的抗性篩選平板上，靜置培養(yǎng)12 d。

方法2（液體預(yù)培養(yǎng)+涂布法）：在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體中加入2 mL 液體再生培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)24 h 后離心去除部分上清液，留100 μL 原生質(zhì)體懸液涂布于30 μg/mL 潮霉素的抗性篩選平板上，靜置培養(yǎng)11 d。

方法3（固體預(yù)培養(yǎng)+雙層培養(yǎng)基法）：將介導(dǎo)后的原生質(zhì)體懸液倒入15 mL 無(wú)抗性再生培養(yǎng)基迅速混勻后倒板，28 ℃培養(yǎng)48 h 后再覆蓋一層30 μg/mL 潮霉素的抗性篩選培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)10 d。

方法4（液體預(yù)培養(yǎng)+雙層培養(yǎng)基法）：在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體中加入2 mL 再生液體培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)48 h 后與含有30 μg/mL 潮霉素的抗性培養(yǎng)基混勻后倒板，靜置培養(yǎng)10 d。

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率，從方法3 所得的擬轉(zhuǎn)化子中選取22 個(gè)提取其基因組，以潮霉素（hygromycin，Hyg）的700 bp 序列作為報(bào)告基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。同時(shí)，從潮霉素抗性篩選平板上刮取少許菌絲涂布于蓋玻片中，以未導(dǎo)入表達(dá)載體的菌絲作為對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀測(cè)綠色熒光蛋白基因的表達(dá)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Graphpad 8.0.2、IBM SPSS Statistic 20等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同裂解酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生情況的影響

細(xì)胞壁裂解酶是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵因素，不同種類的真菌細(xì)胞壁的組成結(jié)構(gòu)差異較大，因此,選用合適的裂解酶對(duì)杏鮑菇原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率很關(guān)鍵。不同裂解酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響見(jiàn)表1。

表1 不同裂解酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生情況的影響Table 1 Effect of different lytic enzymes on the protoplast yield and regeneration

由表1 可知，采用溶壁酶1 處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為7.00×108CFU/mL，為其他裂解酶產(chǎn)量的70～350 倍，且其再生率也顯著高于其他裂解酶的處理，為0.50%，纖維素酶的處理效果最差，原生質(zhì)體產(chǎn)量低，且再生率為0%，與孫勇等[10]的研究結(jié)果相似。綜上，溶壁酶1 的處理效果最佳，這與陶庭磊[11]研究的茶樹花原生質(zhì)體的制備條件優(yōu)化結(jié)果一致。

2.2 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生情況的影響

原生質(zhì)體制備的酶解溫度既要利于原生質(zhì)體的高產(chǎn)，又要防止原生質(zhì)體被破壞。在一定溫度范圍內(nèi)，酶解效率隨著溫度的升高而增加。但溫度過(guò)高不僅降低酶的裂解效率，而且會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體變性破裂，影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率[12]。不同溫度對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)量及再生率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率影響情況Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on protoplast yield and regeneration rate

由圖2 可知，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到最高，為1.51×108CFU /mL。再生率隨著溫度的升高總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，在30 ℃時(shí)再生率最高，為0.40%。說(shuō)明溫度過(guò)低或過(guò)高對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率均有抑制作用，溫度可能通過(guò)影響裂解酶的活性來(lái)影響細(xì)胞壁裂解的效果和再生能力[13]。

2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生情況的影響

原生質(zhì)體制備的酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率具有較大的影響。酶解時(shí)間過(guò)短，原生質(zhì)體形成不完全產(chǎn)量過(guò)低，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞壁被完全清除且原生質(zhì)體膜受到損傷裂解，導(dǎo)致產(chǎn)量和再生率降低[14]。不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis time on protoplast yield and regeneration rate

如圖3 所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在2.0 h 時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率顯著高于其他酶解時(shí)間（P＜0.05），分別為1.25×108CFU /mL 和0.24%。酶解時(shí)間為2.5～3.5 h 時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率無(wú)顯著性差異，表明2.5 h 時(shí)可能為酶解時(shí)間的極限。郭成金等[15]研究表明破壁后細(xì)胞壁的部分殘余組分有助于原生質(zhì)體的再生，若酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將細(xì)胞壁殘余組分完全清除則導(dǎo)致原生質(zhì)體自我修復(fù)能力下降，從而影響再生率[16-17]。因此后續(xù)試驗(yàn)均選用酶解2.0 h 作為最佳酶解時(shí)間。

2.4 不同再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響

穩(wěn)滲劑的選擇對(duì)原生質(zhì)體再生形成菌絲體至關(guān)重要。穩(wěn)滲劑可維持原生質(zhì)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定，保證滲透壓的平衡，防止細(xì)胞膜的破裂或皺縮[12]。不同穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體再生的影響見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，甘露醇作為再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑時(shí)，原生質(zhì)體的再生率（0.20%）顯著高于其他穩(wěn)滲劑（P＜0.05）。這與陳敏等[18]的研究結(jié)果相似。以蔗糖和氯化鈉為穩(wěn)滲劑的培養(yǎng)基再生率為0%，說(shuō)明這兩種穩(wěn)滲劑不利于原生質(zhì)體的修復(fù)，郭成金等[15]在冬蟲夏草原生質(zhì)體制備研究中也觀察到類似的結(jié)果。綜上，選擇甘露醇作為再生培養(yǎng)基的最優(yōu)穩(wěn)滲劑。

2.5 不同潮霉素濃度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響

潮霉素B 是一種氨基糖苷類抗生素，可阻止原核生物和真核生物的蛋白質(zhì)合成。食用菌對(duì)潮霉素具有一定的抗性，通常采用高于致死濃度的潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，因此，潮霉素在食用菌研究應(yīng)用中常被作為一種抗性標(biāo)記[19-20]。不同潮霉素濃度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同潮霉素濃度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響Fig.5 Effect of different hygromycin concentrations on protoplast regeneration

由圖5 可知，在未添加潮霉素的再生培養(yǎng)基（對(duì)照組A）上杏鮑菇原生質(zhì)體的菌落數(shù)最多，約為200 CFU/mL，隨著潮霉素濃度的升高菌落數(shù)逐漸減少，在潮霉素濃度達(dá)到8 μg/mL 時(shí)，再無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明剛制備好的原生質(zhì)體對(duì)潮霉素的敏感度較高。但在轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PEG 介導(dǎo)降低了杏鮑菇原生質(zhì)體對(duì)潮霉素的敏感性，將潮霉素濃度提高到30 μg/mL 時(shí)才能完全抑制再生平板上菌落的生長(zhǎng)。因此，篩選轉(zhuǎn)化子的潮霉素濃度定為30 μg/mL。

2.6 PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化杏鮑菇原生質(zhì)體

PEG 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性以及促進(jìn)外源DNA 與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的互作，因此PEG對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用，為了提高原生質(zhì)體介導(dǎo)后細(xì)胞膜的修復(fù)從而提高原生質(zhì)體的再生率，對(duì)介導(dǎo)后的4 種方式進(jìn)行篩選，4 種方法處理后所得的擬轉(zhuǎn)化子數(shù)和菌落平板分別見(jiàn)圖6 和圖7。

圖6 PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化杏鮑菇原生質(zhì)體4 種方法所得的擬轉(zhuǎn)化子數(shù)Fig.6 Number of putative transformants by four regeneration methods of Pleurotus eryngii protoplasts mediated by PEG

圖7 PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化杏鮑菇原生質(zhì)體所得的擬轉(zhuǎn)化子Fig.7 Putative transformants obtained by PEG-mediated regeneration of Pleurotus eryngii protoplasts

如圖6 所示，4 種不同的PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法的擬轉(zhuǎn)化子數(shù)均有顯著性差異（P＜0.05），方法1～4 的擬轉(zhuǎn)化子數(shù)分別為83、132、338、192 CFU/mL，其中轉(zhuǎn)化方法3 的擬轉(zhuǎn)化子數(shù)最高，可能是因?yàn)榉椒? 對(duì)PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體傷害最小。原生質(zhì)體在進(jìn)行PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后其細(xì)胞膜受到不同程度的損傷[21]，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行離心，可能會(huì)提高原生質(zhì)體膜的破損率，影響擬轉(zhuǎn)化子原生質(zhì)體的再生，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化率。剛介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體活性較低，若直接涂布于潮霉素抗性板上，將提高原生質(zhì)體的致死率[9]，這樣也會(huì)降低轉(zhuǎn)化的效率。本研究中方法1 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行離心并直接涂布于潮霉素抗性篩選平板上，其原生質(zhì)體的破損率高、活性低，因此所得到的擬轉(zhuǎn)化子數(shù)量最少。方法2中介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中恢復(fù)24 h，然后再進(jìn)行離心并涂布于抗性篩選板上，擬轉(zhuǎn)化子數(shù)比方法1 增加了59%，表明轉(zhuǎn)化介導(dǎo)過(guò)后的原生質(zhì)體恢復(fù)培養(yǎng)24 h 有利于提高原生質(zhì)體的活性。方法4 是將介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體恢復(fù)48 h 后，與含有潮霉素的培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，其擬轉(zhuǎn)化子數(shù)比方法2 提高了45%，表明介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體恢復(fù)培養(yǎng)有利于提高轉(zhuǎn)化率[22]。方法3 將轉(zhuǎn)化介導(dǎo)后的原生質(zhì)體倒入無(wú)抗的固體培養(yǎng)基中恢復(fù)2 d，比方法2 和方法4 中加入液體培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化子都高，因此，方法3 的轉(zhuǎn)化篩選方法最佳。

為了驗(yàn)證方法3 的轉(zhuǎn)化效率，則隨機(jī)挑取23 個(gè)擬轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 驗(yàn)證和熒光顯微鏡驗(yàn)證，擬轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證后的電泳膠圖見(jiàn)圖8，熒光蛋白檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖8 擬轉(zhuǎn)化子的PCR 驗(yàn)證Fig.PCR validation diagram of putative transformants

圖9 綠色熒光蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Green fluorescent protein test results

如圖8 所示，1～23 號(hào)轉(zhuǎn)化子中除了1 號(hào)和3 號(hào)，其他擬轉(zhuǎn)化子在1 000 bp 的位置均出現(xiàn)條帶，且以水和野生型為模板未出現(xiàn)條帶，說(shuō)明選取的23 個(gè)擬轉(zhuǎn)化子中有21 個(gè)轉(zhuǎn)化子，由此說(shuō)明轉(zhuǎn)化效率極高，可達(dá)到91%以上。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證其轉(zhuǎn)化子的表達(dá)效率，挑選條帶最亮的19 號(hào)轉(zhuǎn)化子和對(duì)照組野生型菌絲進(jìn)行熒光顯微鏡驗(yàn)證，如圖9 所示，在藍(lán)色激發(fā)光下，可以看出對(duì)照組的菌絲在明場(chǎng)菌絲清晰可見(jiàn)，但在藍(lán)色激發(fā)光下完全看不到綠色熒光，而圖9 B2轉(zhuǎn)化子發(fā)出明亮清晰的綠色熒光，表明質(zhì)粒4 表達(dá)載體已成功導(dǎo)入原生質(zhì)體中并能夠穩(wěn)定表達(dá)[23]，證明所篩選的轉(zhuǎn)化方法3 能顯著提高轉(zhuǎn)化效率并能穩(wěn)定表達(dá)所導(dǎo)入的外源基因。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)杏鮑菇原生質(zhì)體的制備與再生條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的裂解酶為溶壁酶1，當(dāng)酶解溫度為30 ℃、酶解時(shí)間為2 h、再生培養(yǎng)基的穩(wěn)滲劑為甘露醇時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到7×108CFU/mL，再生率達(dá)到0.40%。得到轉(zhuǎn)化子最多的轉(zhuǎn)化方法為方法3固體預(yù)培養(yǎng)+雙層培養(yǎng)基法，所得轉(zhuǎn)化子中的綠色熒光蛋白基因能夠穩(wěn)定有效表達(dá)。