趙桂華, 龔業(yè)莉△, 翁秀芳

1江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)教研室,武漢 430056 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,武漢 430030

MHC Ⅰ類(lèi)分子相關(guān)蛋白1(MR1)是一類(lèi)非經(jīng)典的MHC Ⅰ類(lèi)分子,同CD1d一樣位于1號(hào)染色體,與經(jīng)典的Ⅰ類(lèi)分子不同,人類(lèi)MR1多樣性較低,物種之間具有高度的同源性[1]。MR1和MHCⅠ一樣,具有3個(gè)α結(jié)構(gòu)域(α1～α3)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)[2]。MR1通過(guò)α1～α3與血清β2微球蛋白(β2m)結(jié)合形成完整構(gòu)象,將微生物產(chǎn)生的核黃素代謝產(chǎn)物及其它小分子代謝物提呈給黏膜相關(guān)恒定T(MAIT)細(xì)胞,使MAIT細(xì)胞激活[3-5]。MAIT細(xì)胞是一種在進(jìn)化上高度保守的T細(xì)胞群,其被定義為趨化因子受體6(CCR6)+CD161+或CD161+TCR Vα7.2+,因其主要分布于黏膜且TCR由恒定的α鏈和非恒定的β鏈組成而命名,MAIT細(xì)胞在肝臟疾病和胃腸道黏膜病變中發(fā)揮著重要的作用[6-7]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)能被MR1提呈且被MAIT細(xì)胞識(shí)別的抗原物質(zhì)主要為5-(2-oxopropylideneamino)-6-D-ribitylaminouracil(5-OP-RU)、5-(2-oxoethylideneamino)-6-D-ribitylaminouracil(5-OE-RU)、5-amino-6-D-ribitylaminouracil(5-A-RU)、6-formylpterin(6-FP)以及一些小分子藥物等[5,8]。目前MAIT細(xì)胞的研究工具主要是MR1四聚體,雖然可以對(duì)MAIT細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)與擴(kuò)增,但因其為原核表達(dá)蛋白經(jīng)折疊復(fù)性組裝而成,存在翻譯后修飾障礙,且該四聚體較難獲得[8-9]?；诖?本研究建立MR1/IgG1 Fc二聚體昆蟲(chóng)表達(dá)體系,并利用該二聚體制備MR1/IgG1 Fc二聚體加載的人工抗原提呈細(xì)胞(artificial antigen presenting cells,aAPCs),即MR1 aAPCs,明確該MR1 aAPCs具有有效提呈大腸埃希菌來(lái)源代謝物并激活MAIT細(xì)胞的功能。該體系的建立為后續(xù)研究MAIT細(xì)胞反應(yīng)性代謝物及MAIT細(xì)胞功能提供了新的工具。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞系 pFastBacTMDual質(zhì)粒、Sf9細(xì)胞均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫系保存,感受態(tài)大腸埃希菌DH5α、DH10BacTM購(gòu)自武漢易白生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 引物均由擎科公司合成;XhoⅠ、KpnⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶及硫酸鹽乳膠微珠(Beads)均購(gòu)自賽默飛公司;X-gal、IPTG購(gòu)自白鯊(Biosharp)公司;T4連接酶和轉(zhuǎn)染試劑(HighGene plus Transfection reagent)購(gòu)自ABclonal公司;Sf9細(xì)胞培養(yǎng)液(SIM SF)購(gòu)自義翹神州公司;純化的鼠抗人CD28(Clone:28.2)購(gòu)自Biolegend公司。流式抗體:APC-CY7標(biāo)記抗人CD3(Clone:UCHT1),PE-CY7標(biāo)記抗人Vα7.2(Clone:3C10),APC標(biāo)記抗人CD161(Clone:HP-3G10),PE標(biāo)記抗人CD69(Clone:FN50),PE標(biāo)記抗人MR1(Clone:26.5)均購(gòu)自BioLegend公司。兔抗人IgG Fc(貨號(hào):SPA205),APC標(biāo)記羊抗兔IgG(貨號(hào):K0034G-APC),羊抗人IgG Fc(貨號(hào):SPA105),HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fc(貨號(hào):SE105)均購(gòu)自索萊寶(Solarbio)公司;CFSE(羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 pFastBacTM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]質(zhì)粒的構(gòu)建

分離健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用表1中的β2m-F1和β2m-R1引物通過(guò)RT-PCR獲得β2m基因片段;通過(guò)Pubmed獲取人MR1胞外段序列(α1、α2和α3)和人IgG1 Fc序列,送武漢擎科公司進(jìn)行MR1胞外段和IgG1 Fc融合基因的全序列基因合成,構(gòu)建pcDNA3.1(+)-[MR1/IgG1 Fc]質(zhì)粒,利用表1的MR1-Fc-F2和MR1-Fc-R2引物擴(kuò)增獲得MR1/IgG1 Fc基因片段。將MR1/IgG1 Fc插入pFastBacTMDual的Pph啟動(dòng)子下游,將β2m插入pFastBacTMDual的Pp10啟動(dòng)子下游。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆,用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)PCR鑒定后再經(jīng)過(guò)雙向測(cè)序鑒定(由武漢擎科公司完成),最終形成一個(gè)Pph方向含MR1/IgG1 Fc,Pp10方向含β2m的pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]質(zhì)粒,結(jié)構(gòu)如圖1A所示;將鑒定正確的pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆,按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)提取含β2m+MR1/IgG1 Fc的穿梭質(zhì)粒Bacmid(138 kb),經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序。

1.3 MR1/IgG1 Fc融合蛋白的表達(dá)和檢測(cè)

用SIM SF(不含血清及蛋白)培養(yǎng)液于27℃無(wú)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞,2～3 d換1次液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用重組桿粒Bacmid+[β2m+MR1/IgG1 Fc]和HighGene plus轉(zhuǎn)染試劑混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。待Sf9細(xì)胞全部由梭形變?yōu)閳A形且細(xì)胞直徑變大,胞內(nèi)顆粒增多,收獲培養(yǎng)上清,此上清中含有攜帶β2m+MR1/IgG1 Fc基因的病毒,再用此上清感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞,待擴(kuò)增到P3時(shí),大量感染Sf9細(xì)胞,5～6 d收集上清,即得到大量含有MR1/IgG1 Fc融合蛋白的上清。MR1/IgG1 Fc融合蛋白可通過(guò)Fc段經(jīng)鏈間二硫鍵連接形成MR1/IgG1 Fc二聚體,具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1B。利用ELISA和Western blot對(duì)MR1/IgG1 Fc二聚體進(jìn)行檢測(cè)。將兔抗人IgG Fc抗體包被于硫酸鹽乳膠微珠(dynalbeads)上,用APC標(biāo)記羊抗兔IgG檢測(cè)包被率。將濃縮后的MR1/IgG1 Fc二聚體與包被了兔抗人IgG Fc抗體的dynalbeads 4℃孵育24 h,用PE標(biāo)記抗人MR1抗體檢測(cè)MR1/ IgG1 Fc二聚體的構(gòu)象。

1.4 基于MR1/IgG1 Fc二聚體人工抗原提呈細(xì)胞的建立及加載大腸埃希菌來(lái)源代謝物質(zhì)

將純化后的鼠抗人CD28抗體和兔抗人IgG1 Fc抗體包被在dynalbeads上,BSA封閉后與濃縮后富含MR1/IgG1 Fc二聚體的細(xì)胞培養(yǎng)上清4℃孵育24 h,制備獲得加載MR1/IgG1 Fc二聚體的MR1 aAPCs,結(jié)構(gòu)如圖1C所示。培養(yǎng)擴(kuò)增DH5α,離心收集培養(yǎng)上清以及DH5α細(xì)菌沉淀。取培養(yǎng)上清、細(xì)菌沉淀裂解后的水溶性物質(zhì)、細(xì)菌沉淀裂解后的脂溶性物質(zhì),分別與上述制備好的MR1 aAPCs于4℃孵育24 h,制備成加載不同代謝物的MR1 aAPCs,即DH5α培養(yǎng)上清代謝物/MR1 aAPCs、DH5α水溶性代謝物/MR1 aAPCs、DH5α脂溶性物質(zhì)/MR1 aAPCs。

1.5 MAIT細(xì)胞活化檢測(cè)

分離健康個(gè)體的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),調(diào)整濃度至5×106/mL,與加載了不同DH5α代謝物質(zhì)的MR1 aAPCs按2∶1比例共培養(yǎng),每組細(xì)胞按200 μL體積培養(yǎng),培養(yǎng)體系中均加入IL-2(終濃度為20 IU/mL),培養(yǎng)1 d后收細(xì)胞,按照說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量的抗體(APC-CY7標(biāo)記抗人CD3、PE-CY7標(biāo)記抗人Vα7.2、APC標(biāo)記抗人CD161、PE標(biāo)記抗人CD69),室溫孵育30 min,PBS洗滌2次,1500 r/min離心10 min,200 μL PBS重懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀(FACSVerse,BD Bioscience,美國(guó))對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果分析采用FlowJo軟件。

1.6 MAIT細(xì)胞增殖檢測(cè)

分離健康個(gè)體的PBMCs,將分離的PBMCs用不含血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸至1×107/mL,加入CFSE染料(使終濃度為5 μmol/ mL),混勻,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min后加入冰胎牛血清5 mL,混勻后放37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 min,孵育結(jié)束后補(bǔ)滿PBS,1500 r/min離心10 min,洗滌2遍,去除未結(jié)合的染料。CFSE標(biāo)記好的PBMC用RPMI1640培養(yǎng)液重懸,調(diào)整PBMC濃度為5×106/mL,與加載了不同DH5α代謝物質(zhì)的MR1 aAPCs按2∶1比例共培養(yǎng),每組細(xì)胞按200 μL體積培養(yǎng),培養(yǎng)體系中均加入IL-2(終濃度為20 IU/mL),培養(yǎng)7 d后收細(xì)胞,用相應(yīng)的抗體進(jìn)行染色,采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)(方法同1.5)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 pFastBacTM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

為了驗(yàn)證構(gòu)建獲得的pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]表達(dá)質(zhì)粒的正確性,我們通過(guò)特異性引物擴(kuò)增pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]質(zhì)粒中β2m與MR1/IgG1 Fc融合基因,并通過(guò)DNA電泳檢測(cè)其分子量大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中β2m編碼基因?yàn)?60 bp,MR1/IgG1 Fc融合基因?yàn)?902 bp,片段大小與預(yù)期一致(圖2)。將pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10BacTM中,提取重組桿粒(Bacmid)后用M13通用型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,未插入目的片段的Bacmid擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2560 bp,而插入目的片段后大小為4822 bp,電泳條帶在5000 bp左右(圖2),表明目的片段已成功插入桿粒中,含β2m+MR1/IgG1 Fc的穿梭質(zhì)粒Bacmid構(gòu)建成功。經(jīng)過(guò)PCR鑒定正確的質(zhì)粒送武漢擎科公司進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定,測(cè)序結(jié)果與GenBank比對(duì)完全一致,進(jìn)一步證實(shí)了堿基序列也完全無(wú)誤(測(cè)序結(jié)果未顯示)。

2.2 MR1/IgG1 Fc二聚體的檢測(cè)及鑒定

用羊抗人IgG Fc和HRP標(biāo)記羊抗人IgG Fc抗體進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)感染Sf9細(xì)胞的不同代感染培養(yǎng)上清中MR1/IgG1 Fc二聚體的含量。結(jié)果顯示,在感染Sf9細(xì)胞第2代上清(P2)中開(kāi)始檢測(cè)到目的蛋白,在第3代(P3)的培養(yǎng)上清中MR1/IgG1 Fc二聚體的含量達(dá)到最高[(5.4±0.2)μg/mL](圖3A)。取P3代的MR1/IgG1 Fc二聚體經(jīng)β-巰基乙醇還原以后進(jìn)行SDS變性聚丙烯凝膠電泳,用HRP標(biāo)記羊抗人IgG Fc抗體可檢測(cè)到在75 kD至100 kD之間的蛋白條帶,與預(yù)期大小(90 kD)相符,結(jié)果如圖3B、3C所示。

為了進(jìn)一步明確MR1/IgG1 Fc二聚體構(gòu)象的正確性以及用于制備MR1 aAPCs的可行性,我們通過(guò)兔抗人IgG Fc抗體包被,并特異性結(jié)合MR1/IgG1 Fc二聚體,從而加載MR1/IgG1 Fc二聚體到dynalbeads上,并通過(guò)抗完整構(gòu)象MR1分子的抗體進(jìn)行檢測(cè)。首先,應(yīng)用APC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體檢測(cè)兔抗人IgG Fc抗體包被率,結(jié)果顯示:兔抗人IgG Fc抗體能有效地包被在dynalbeads上,包被率為(94.25±3.38)%。將已包被兔抗人IgG Fc抗體的dynalbeads與MR1/IgG1 Fc二聚體上清孵育24 h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示MR1陽(yáng)性率達(dá)(80.68±2.11)%,結(jié)果如圖4所示。由于PE標(biāo)記抗人MR1抗體是一種可以識(shí)別完整構(gòu)象MR1的單克隆抗體,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了MR1/IgG1 Fc二聚體具有正確的天然構(gòu)象,并且通過(guò)兔抗人IgG Fc抗體包被,特異性結(jié)合MR1/IgG1 Fc二聚體,可有效加載完整構(gòu)象的MR1/IgG1 Fc二聚體到dynalbeads上,并基于此方式制備MR1 aAPCs。

2.3 加載DH5α源性代謝物的MR1 aAPCs對(duì)MAIT細(xì)胞活化與增殖的影響

取DH5α培養(yǎng)上清、細(xì)菌沉淀裂解后的水溶性重懸液、細(xì)菌沉淀裂解后的脂溶性重懸液,加載制備好的MR1 aAPCs制備成DH5α培養(yǎng)上清/MR1 aAPCs、DH5α水溶性代謝物/MR1 aAPCs、DH5α脂溶性物質(zhì)/MR1 aAPCs,并刺激健康人PBMCs。結(jié)果顯示:與PBMCs對(duì)照組相比,DH5α培養(yǎng)上清/MR1 aAPCs與DH5α水溶性代謝物/MR1 aAPCs均能顯著提高M(jìn)AIT細(xì)胞中CD69+細(xì)胞比例,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[CD69+MAIT細(xì)胞頻率:(34.97±3.67)%vs.(6.97±1.38)%,P<0.05;(43.8±6.81)%vs.(6.97±1.38)%,P<0.05],DH5α脂溶性物質(zhì)/MR1 aAPCs共培養(yǎng)組中MAIT細(xì)胞CD69+細(xì)胞比例增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[CD69+MAIT細(xì)胞頻率:(15.41±10.75)%vs.(6.97±1.38)%,P>0.05](圖5)。這些結(jié)果提示DH5α培養(yǎng)上清及水溶性裂解代謝物中含有能夠刺激MAIT細(xì)胞活化的物質(zhì)。

應(yīng)用DH5α培養(yǎng)上清/MR1 aAPCs、DH5α水溶性代謝物/MR1 aAPCs、DH5α脂溶性物質(zhì)/MR1 aAPCs,進(jìn)行PBMCs 7 d刺激與增殖檢測(cè),結(jié)果顯示:與PBMCs對(duì)照組相比,DH5α培養(yǎng)上清/MR1 aAPCs與DH5α水溶性物質(zhì)/MR1 aAPCs均能誘導(dǎo)MAIT細(xì)胞增殖水平增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[增殖MAIT細(xì)胞比例:(33.2±0.9)%vs.(12.8±4.03)%,P<0.05;(36.95±2.35)%vs.(12.8±4.03)%,P<0.05],DH5α脂溶性物質(zhì)/MR1 aAPCs也能誘導(dǎo)MAIT細(xì)胞增殖水平增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[增殖MAIT細(xì)胞比例:(18.33±9.37)%vs.(12.8±4.03)%,P>0.05](圖6)。以上結(jié)果說(shuō)明,基于MR1的抗原提呈細(xì)胞(MR1 APCs)具有提呈大腸埃希菌來(lái)源代謝物質(zhì)的功能,并且能夠誘導(dǎo)MAIT細(xì)胞活化和增殖水平增加。

這些結(jié)果綜合說(shuō)明基于MR1/IgG1 Fc二聚體的aAPCs能夠有效刺激MAIT細(xì)胞,并篩選鑒定含有MAIT細(xì)胞反應(yīng)性的復(fù)雜細(xì)菌代謝混合物;DH5α培養(yǎng)上清及水溶性裂解代謝物中含有促進(jìn)MAIT細(xì)胞活化與增殖的代謝物。

3 討論

MR1是一種多樣性較低的MHC Ⅰ分子類(lèi)似物[10],在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中高度保守。在人類(lèi)中,它存在于染色體1q25.3上,與CD1基因非常接近[11]。MR1提呈的抗原可被MAIT細(xì)胞識(shí)別而激活MAIT細(xì)胞[12-13]。MAIT細(xì)胞的激活可通過(guò)TCR依賴性和非TCR依賴性途徑,TCR途徑主要是通過(guò)識(shí)別MR1提呈的細(xì)菌核黃素代謝途徑產(chǎn)物[14-16],非TCR途徑主要是細(xì)胞因子IL-12和IL-18的刺激[17]。已有的研究表明,MAIT細(xì)胞可以被MR1提呈的細(xì)菌核黃素途徑維生素B類(lèi)代謝物激活,如5-OP-RU和5-OE-RU,但不能被6-FP和acetyl-6-formylpterin(Ac-6-FP)等激活,這是因?yàn)檫@些物質(zhì)與MAIT細(xì)胞的TCR沒(méi)有相互作用[18-19]。然而,MAIT細(xì)胞的激活和抑制配體仍不明確,5-OP-RU是迄今為止最有效的MAIT細(xì)胞激活劑,因?yàn)樗軌蛏险{(diào)MR1并與MAIT細(xì)胞的TCR相互作用[20]。MAIT細(xì)胞目前的研究工具主要是將典型配體5-OP-RU與MR1四聚體結(jié)合形成的5-OP-RU/MR1四聚體,用于鑒定MAIT細(xì)胞。此外,將裝載抗原的MR1四聚體和人CD28抗體加載至乳膠珠上制成人工抗原提呈細(xì)胞可用于擴(kuò)增MAIT細(xì)胞[21-22]。雖然裝載5-OP-RU的MR1四聚體可以最大程度地檢測(cè)和擴(kuò)增MAIT細(xì)胞,但由于MR1四聚體中MR1分子為原核表達(dá),5-OP-RU與MR1四聚體的結(jié)合較難被其他物質(zhì)替換,所以該工具在研究新的MAIT細(xì)胞激活物中存在局限。為了拓展MAIT細(xì)胞激活物的研究,本研究將MR1胞外段抗原識(shí)別區(qū)域與IgG1 Fc段基因通過(guò)基因拼接技術(shù)和Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有MR1二聚體結(jié)構(gòu)的蛋白,在MR1二聚體的抗原識(shí)別區(qū)域加載抗原物質(zhì)即可探究影響MAIT細(xì)胞活化的物質(zhì)。我們選擇大腸埃希菌來(lái)源的代謝物作為研究對(duì)象。研究結(jié)果顯示,大腸埃希菌(DH5α)培養(yǎng)上清及水溶性裂解物能夠被MR1 aAPCs所提呈并成功激活MAIT細(xì)胞,說(shuō)明水溶性代謝物能更好地使MAIT細(xì)胞活化和增殖。已有研究表明5-OP-RU通過(guò)分子間極性接觸網(wǎng)在MR1 A′結(jié)構(gòu)槽中定位,其中包括其5-OH以及2-OH基團(tuán)與MAIT細(xì)胞TCR之間的氫鍵作用,而分子的極性特征也決定其水溶性,因此我們推測(cè)代謝物的分子基團(tuán)結(jié)構(gòu)與其能使MAIT細(xì)胞活化和增殖的程度相關(guān)[18],后續(xù)將對(duì)結(jié)合在MR1 aAPCs上的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步研究,探究其結(jié)構(gòu)特征。上述結(jié)果表明,我們前期構(gòu)建的MR1二聚體具有生物學(xué)功能,且基于MR1二聚體的人工抗原提呈細(xì)胞將為研究MAIT細(xì)胞反應(yīng)性代謝物及MAIT細(xì)胞功能提供新的工具。