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蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7抗食管癌的機(jī)制研究*

2023-11-09 01:12:26張家銘水潁彬袁亞萍高社干李鐘杰
關(guān)鍵詞:多肽線粒體食管癌

張家銘, 水潁彬, 楊 青 , 袁亞萍, 高社干, 李鐘杰△

1河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,洛陽(yáng) 471000 2河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院,洛陽(yáng) 471000

食管癌是全球第八大常見類型癌癥,同時(shí)也是我國(guó)所有癌癥中第五大最常見的類型[1-3]。作為我國(guó)第四大致死性腫瘤,我國(guó)的食管癌年發(fā)病數(shù)量大約25萬例,5年生存率低于20%,每年約19萬例患者死于食管癌[4-6]。手術(shù)、化療和放療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中治療食管癌的常規(guī)手段,但腫瘤耐藥性是食管癌防治中最為棘手的問題。高耐藥性指的是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性降低,從而使得療效變差,患者生存期縮短。因此,迫切需要開發(fā)新的治療方案和研發(fā)新型治療藥物。在發(fā)掘新的有效藥物方面,多肽類活性分子是研究熱點(diǎn)之一,其具有毒副作用小、耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。

蝎子在世界范圍內(nèi)用作傳統(tǒng)藥物已有數(shù)千年的歷史,蝎毒液中的多肽是其主要的藥用活性成分[9-10]。已有研究表明,從不同蝎種中獲得的毒液多肽在神經(jīng)、免疫、感染、心血管、腫瘤等多系統(tǒng)疾病中都有著良好的治療效果[11]。蝎毒多肽Ctry2459[12]是從西藏特里豚蝎Chaerilustryznai中發(fā)現(xiàn)的一種抗微生物多肽,而CT-K3K7是基于Ctry2459的優(yōu)化體多肽,其具有良好的抗菌活性,并被認(rèn)為是治療金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌感染的潛在抗菌劑候選物[13]。本研究中,我們對(duì)CT-K3K7的抗食管癌作用進(jìn)行了探究,以期為抗食管癌藥物的研發(fā)提供新的思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

食管癌細(xì)胞系KYSE70和KYSE150購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司);胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青-鏈霉素(Gibco公司);CCK-8試劑盒(Invigentech公司);碘化丙啶(propidium iodide,PI)(索萊寶科技有限公司);線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);PVDF膜(Thermo Fisher Scientific公司);Anti-Bcl-2兔單克隆抗體(Abcam公司);Anti-Bax兔單克隆抗體(Abcam公司);Anti-Caspase-3小鼠單克隆抗體(Santa Cruz公司);BCA蛋白定量試劑、BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司);GAPDH抗體(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司);ECL發(fā)光顯影試劑盒(Invitrogen公司)。光學(xué)顯微鏡(尼康);凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司);流式細(xì)胞儀(BD公司);共聚焦顯微鏡(ZEISS公司)。

1.2 多肽及細(xì)胞培養(yǎng)

多肽CT-K3K7(FLKFLKKLF)由上海吉爾生化有限公司合成,其C端酰胺化,純度>95%。CT-K3K7以凍干粉形式分裝,存放于-20℃以避免反復(fù)凍融。在使用時(shí),將其溶解于生理鹽水中。KYSE70與KYSE150細(xì)胞在含有10% FBS、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,放置于5% CO2、37℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

利用CCK-8試劑檢測(cè)CT-K3K7干預(yù)后KYSE70與KYSE150細(xì)胞增殖的變化[14]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE70及KYSE150細(xì)胞,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,每孔接種2×103個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CT-K3K7的工作濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL,并設(shè)置不含有CT-K3K7的對(duì)照組。將CT-K3K7按設(shè)定的濃度分組加入細(xì)胞已貼壁的96孔板中,十字法搖勻,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL的CCK-8溶液,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育,2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=(A藥物組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。通過GraphPad軟件計(jì)算其半抑制濃度(IC50)值,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定最終濃度。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)

利用平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)CT-K3K7對(duì)KYSE70與KYSE150增殖能力的影響[15]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE70和KYSE150細(xì)胞,按細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞放置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照前期實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的IC50值,在KYSE70細(xì)胞系中選取CT-K3K7的工作濃度為5、10、20 μg/mL;KYSE150細(xì)胞系中選取CT-K3K7的工作濃度為10、20、40 μg/mL開展后續(xù)實(shí)驗(yàn),且兩種細(xì)胞系均設(shè)置只加PBS的對(duì)照組。按照選取的工作濃度,CT-K3K7在6孔培養(yǎng)板中作用細(xì)胞6 h。用胰蛋白酶將CT-K3K7干預(yù)后的細(xì)胞消化,再以每孔2×103個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板,放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直到6孔板底部肉眼可見大量細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng),棄去上清后以PBS洗滌2遍,每孔加入1 mL 40%多聚甲醛,于室溫下固定20~40 min,4%結(jié)晶紫染色,低倍鏡下拍照并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率,進(jìn)一步評(píng)估CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CT-K3K7干預(yù)下KYSE70與KYSE150遷移能力的變化[15]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE70和KYSE150細(xì)胞,按細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板。將細(xì)胞放置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)80%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照1.4中CT-K3K7的工作濃度對(duì)KYSE70和KYSE150細(xì)胞進(jìn)行分組。CT-K3K7在6孔培養(yǎng)板中作用細(xì)胞6 h。用200 μL無菌槍頭對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行劃痕,以PBS洗滌以清除漂浮的細(xì)胞,隨后將細(xì)胞放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并于0 h和24 h在低倍鏡下拍照,觀察細(xì)胞遷移面積的變化,評(píng)估CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響。

1.6 PI吸收測(cè)定

利用PI吸收實(shí)驗(yàn)探究CT-K3K7是否能夠破壞KYSE70與KYSE150細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性[16]。按照選取的實(shí)驗(yàn)濃度將CT-K3K7加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞6孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h。終止培養(yǎng)后用5 μg/mL PI避光處理10 min,PBS洗滌3次。最后使用共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化,以評(píng)估CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞細(xì)胞膜完整性的影響。

1.7 線粒體膜電位(MMP)檢測(cè)

利用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒測(cè)定CT-K3K7干預(yù)后KYSE70與KYSE150的線粒體膜電位的變化[16]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE70和KYSE150細(xì)胞,按照選取的實(shí)驗(yàn)濃度加入CT-K3K7,于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h。胰蛋白酶消化細(xì)胞,4℃條件下1000×g離心3 min收集細(xì)胞。按照試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算FL1與FL2比值用以評(píng)估CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響。

1.8 活性氧(ROS)檢測(cè)

利用ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)定CT-K3K7干預(yù)后KYSE70與KYSE150的活性氧水平[17]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE70和KYSE150細(xì)胞,按照選取的實(shí)驗(yàn)濃度加入CT-K3K7,于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h。胰蛋白酶消化細(xì)胞,4℃條件下1000×g離心3 min收集細(xì)胞。按照ROS檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)處理,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CT-K3K7干預(yù)后KYSE70與KYSE150的凋亡水平[18]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE70和KYSE150細(xì)胞,按照選取的實(shí)驗(yàn)濃度加入CT-K3K7,于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h。孵育結(jié)束后收集上清和細(xì)胞于室溫下1000×g離心5 min,加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,再加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC以及10 μL碘化丙啶染色液室溫避光20 min,立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,分析CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡水平的影響。

1.10 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)

利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CT-K3K7干預(yù)后KYSE70與KYSE150的相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的變化[19]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE70和KYSE150細(xì)胞,按照選取的實(shí)驗(yàn)濃度加入CT-K3K7,于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h。孵育結(jié)束后利用RIPA蛋白裂解液提取蛋白并經(jīng)BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,將各組蛋白加至電泳槽進(jìn)行電泳(90 V,100 min);待電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇激活的PVDF膜(0.2 μm)(80 V,150 min);隨后利用脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗滌,孵育凋亡相關(guān)蛋白抗體Caspase-3(1∶500)、Bcl-2(1∶1000)及Bax(1∶1000),洗滌后孵育相應(yīng)二抗,最后以ECL顯色,于凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白的表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7抑制食管癌細(xì)胞增殖

通過CCK-8法檢測(cè)CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE70與KYSE150細(xì)胞增殖能力的影響。如圖1A和1B所示,KYSE70在CT-K3K7干預(yù)下,其生長(zhǎng)狀況與對(duì)照組相比均受到不同程度的抑制,其IC50為17.91 μg/mL。并且隨著CT-K3K7作用濃度的升高,CT-K3K7對(duì)KYSE70的抑制作用逐漸增強(qiáng)(均P<0.05)。圖1C和1D顯示,隨著CT-K3K7作用濃度的升高,其對(duì)KYSE150細(xì)胞活力的抑制作用逐漸增強(qiáng),其IC50為39.52 μg/mL。與對(duì)KYSE70細(xì)胞的作用類似,CT-K3K7對(duì)KYSE150細(xì)胞的增殖抑制作用也呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性,表明CT-K3K7具有抑制食管癌細(xì)胞增殖的作用。

A:KYSE70細(xì)胞經(jīng)不同濃度CT-K3K7處理24 h后的細(xì)胞活力;B:CT-K3K7對(duì)KYSE70細(xì)胞的濃度效應(yīng)曲線;C:KYSE150細(xì)胞經(jīng)不同濃度CT-K3K7處理24 h后的細(xì)胞活力;B:CT-K3K7對(duì)KYSE150的濃度效應(yīng)曲線;與對(duì)照組(0 μg/mL組)比較, *P<0.05 ** P<0.01 圖1 CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of CT-K3K7 on proliferation of esophageal cancer cells

2.2 蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7抑制食管癌細(xì)胞克隆形成

通過平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE70與KYSE150細(xì)胞增殖能力的影響。如圖2所示,CT-K3K7處理組的細(xì)胞克隆形成率均低于對(duì)照組,且隨著作用濃度的升高CT-K3K7對(duì)KYSE70(圖2A、2B)與KYSE150(圖2C、2D)克隆形成的抑制作用逐漸增強(qiáng),呈顯著劑量依賴效應(yīng)(均P<0.05)。

A:KYSE70細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)圖;B:不同濃度CT-K3K7處理后KYSE70細(xì)胞克隆形成率;C:KYSE150細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)圖;D:不同濃度CT-K3K7處理后KYSE150細(xì)胞克隆形成率;與對(duì)照組(0 μg/mL組)比較, * P<0.05 ** P<0.01圖2 CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響Fig.2 Effect of CT-K3K7 on the clonogenic ability of esophageal cancer cells in vitro

2.3 蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7抑制食管癌細(xì)胞遷移能力

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果如圖3所示,與對(duì)照組相比,經(jīng)過CT-K3K7處理后的KYSE70(圖3A、3B)與KYSE150(圖3C、3D)細(xì)胞的遷移能力隨著CT-K3K7作用濃度的升高明顯降低,呈現(xiàn)顯著劑量依賴效應(yīng)(均P<0.01)。

A:KYSE70細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);B:KYSE70細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)圖;C:KYSE150細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);D:KYSE150細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)圖;與對(duì)照組(0 μg/mL組)比較,**P<0.01圖3 CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞體外遷移能力的影響Fig.3 Effect of CT-K3K7 on the migration ability of esophageal cancer cells in vitro

2.4 蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7破壞食管癌細(xì)胞膜完整性

為探究CT-K3K7是否能夠破壞細(xì)胞膜,通過對(duì)CT-K3K7處理后的KYSE70與KYSE150細(xì)胞進(jìn)行PI染色以檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。如圖4所示,與對(duì)照組相比,CT-K3K7干預(yù)后的KYSE70與KYSE150細(xì)胞隨著多肽作用濃度的升高,熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多,與對(duì)照組差異明顯。以上結(jié)果表明,CT-K3K7能夠破壞食管癌細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性,這一作用與CT-K3K7濃度呈正相關(guān)。同時(shí)也提示CT-K3K7可能對(duì)食管癌細(xì)胞具有直接殺傷作用。

圖4 CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的影響Fig.4 Effect of CT-K3K7 on the cell membrane permeability of esophageal cancer cells

2.5 蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7引起食管癌細(xì)胞線粒體功能障礙

為驗(yàn)證CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE70與KYSE150線粒體功能的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CT-K3K7干預(yù)后食管癌細(xì)胞KYSE70與KYSE150線粒體膜電位與ROS水平的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,CT-K3K7干預(yù)后的KYSE70(圖5A、5B)與KYSE150細(xì)胞(圖5C、5D)的線粒體膜電位顯著下降(均P<0.05);經(jīng)CT-K3K7干預(yù)后,KYSE70(圖5E、5F)與KYSE150(圖5G、5H)細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(均P<0.05),并且兩者都呈顯著的濃度依賴性。

2.6 蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7引起食管癌細(xì)胞凋亡

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI檢測(cè)CT-K3K7對(duì)KYSE70與KYSE150細(xì)胞凋亡的影響,并通過Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖5I、5L所示,經(jīng)CT-K3K7干預(yù)后的食管癌細(xì)胞凋亡水平顯著高于對(duì)照組,且與CT-K3K7濃度呈正相關(guān)(均P<0.05)。凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、及Bax/Bcl-2比值是評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡水平的重要指標(biāo),Western blot結(jié)果(圖6)顯示,與對(duì)照組相比,CT-K3K7處理的KYSE70與KYSE150細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量隨著CT-K3K7濃度升高顯著下調(diào)(均P<0.05),而Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量則隨著CT-K3K7作用濃度的升高顯著上調(diào)(均P<0.05),Bax/Bcl-2比值明顯升高(均P<0.05)。該結(jié)果進(jìn)一步表明CT-K3K7能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡,并且這一效應(yīng)具有顯著的劑量依賴性。

A:KYSE70細(xì)胞蛋白印跡實(shí)驗(yàn)代表性圖片;B:KYSE70細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)量;C:KYSE70細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量;D:KYSE70細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量;E:KYSE70細(xì)胞中Bax與Bcl-2的比值;F:KYSE150細(xì)胞蛋白印跡實(shí)驗(yàn)代表性圖片;G:KYSE150細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)量;H:KYSE150細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量;I:KYSE150細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量;J:KYSE150細(xì)胞中Bax與Bcl-2的比值;與對(duì)照組(0 μg/mL組)比較,* P<0.05 **P<0.01圖6 CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響Fig.6 Effect of CT-K3K7 on the expression of Caspase-3,Bax,and Bcl-2 in esophageal cancer cells

3 討論

多肽是一類具有良好開發(fā)前景的藥物候選分子,對(duì)病毒、細(xì)菌、癌癥、真菌均表現(xiàn)出良好的活性,且不易產(chǎn)生耐藥性[20-21]。蝎子作為寶貴的傳統(tǒng)藥物資源[22-25],其毒液是發(fā)掘抗癌多肽的良好資源。目前已經(jīng)從多個(gè)蝎品種中發(fā)掘出許多具有抗癌作用的蝎毒多肽,如來自東亞鉗蝎的蝎毒肽BmKn-2對(duì)人口腔癌與結(jié)直腸癌細(xì)胞具有殺傷作用[26-27]、來自Vaejovismexicanus的VmCT1對(duì)乳腺癌的抗癌特性[28]和來自Scorpiomauruspalmatus的蝎毒肽Smp24與Smp43對(duì)人肺癌與肝癌的抗腫瘤作用[29-31]。蝎毒多肽優(yōu)化CT-K3K7是基于西藏特里豚蝎抗微生物多肽Ctry2459的改造肽,具有較好的體內(nèi)外抗菌作用[13]。

癌細(xì)胞的增殖能力在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,抗癌多肽如Eucalrobusone C[32]、Carnosic acid[33]、Cordycepin[34]在抗腫瘤的過程中可通過干預(yù)細(xì)胞的增殖能力來發(fā)揮作用。本研究證實(shí)CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用,且具有濃度依賴性(圖1)。為進(jìn)一步探究CT-K3K7對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響,本研究探究了CT-K3K7對(duì)KYSE70與KYSE150細(xì)胞克隆形成的影響。結(jié)果表明,CT-K3K7可以顯著抑制KYSE70與KYSE150細(xì)胞的克隆形成(圖2),進(jìn)一步說明CT-K3K7有效地抑制了KYSE70與KYSE150細(xì)胞的增殖。癌轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因,而癌細(xì)胞遷移則是癌轉(zhuǎn)移的重要初始步驟[35],抗癌多肽如Smp43、Cecropins、與Smp24通過抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力[29,31,36]來干預(yù)癌癥的發(fā)展。為此,本研究進(jìn)一步探究了CT-K3K7對(duì)KYSE70與KYSE150細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)果表明,CT-K3K7對(duì)KYSE70與KYSE150遷移能力具有顯著的抑制性,并有顯著的濃度依賴效應(yīng)(圖3)。對(duì)于抗癌多肽來說,其通常可以直接與癌細(xì)胞細(xì)胞膜相互作用,通過與膜脂質(zhì)相互作用,引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變,破壞細(xì)胞膜的完整性從而起到直接殺傷癌細(xì)胞的作用,如抗癌多肽HPRP-A2[16]、Smp24[37]和CT-p19LC[38]。本研究通過PI吸收檢測(cè)表明CT-K3K7能夠?qū)YSE70與KYSE150細(xì)胞膜完整性造成破壞(圖4),并且造成KYSE70與KYSE150活力顯著下降,這表明CT-K3K7可通過破壞食管癌細(xì)胞膜直接殺傷食管癌細(xì)胞。對(duì)抗癌多肽而言,破壞細(xì)胞膜完整性并不是其唯一的抗腫瘤機(jī)制,其能夠通過與線粒體作用,破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能導(dǎo)致線粒體功能障礙,從而誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體途徑凋亡[39-40],如抗癌多肽Isoorientin[41]、CSEI[42]、Bombesin related peptides[43]等皆具有此效應(yīng)。而線粒體膜電位去極化和ROS富集是線粒體功能障礙的重要表現(xiàn)。本研究通過進(jìn)一步的流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CT-K3K7引起KYSE70與KYSE150細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的去極化(圖5A~5D)與ROS水平上升(圖5E~5H)并且導(dǎo)致KYSE70與KYSE150的凋亡率的上升(圖5I~5L)。Bcl-2與Bax是凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子,而Bax和Bcl-2的促凋亡及抗凋亡作用相互制衡,通常在體內(nèi)可通過復(fù)雜的機(jī)制調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡,但當(dāng)細(xì)胞處于異常應(yīng)激狀態(tài)時(shí),出于細(xì)胞本能反應(yīng),往往伴隨Bax表達(dá)水平提高的同時(shí)Bcl-2的表達(dá)受到抑制進(jìn)而打破穩(wěn)態(tài)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[44]。進(jìn)一步的結(jié)果表明,經(jīng)CT-K3K7干預(yù)后的食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及促凋亡蛋白Bax表達(dá)量均顯著升高,同時(shí)伴隨抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯降低(圖6)。由此可見,CT-K3K7不僅可通過破壞細(xì)胞膜完整性,直接殺傷食管癌細(xì)胞,還可以通過介導(dǎo)食管癌細(xì)胞線粒體功能障礙來誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗癌作用。

綜上所述,CT-K3K7可以有效抑制食管癌細(xì)胞KYSE70與KYSE150的增殖并具有濃度依賴性,并抑制其遷移能力。CT-K3K7可通過破壞細(xì)胞膜直接殺傷食管癌細(xì)胞,也可以導(dǎo)致食管癌細(xì)胞線粒體功能障礙最終引起食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,蝎毒多肽優(yōu)化體CT-K3K7具有作為抗腫瘤分子藥物的潛力并為研發(fā)抗食管癌藥物提供了新的候選分子或分子模板。

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