覃 艷, 趙可雷, 李 燕, 朱云峰, 曹 萌

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1內(nèi)分泌科二病區(qū) 2腫瘤內(nèi)科二病區(qū),新鄉(xiāng) 453100

甲狀腺癌屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的一種,發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),預(yù)計(jì)該疾病將成為全球第四大主要癌癥[1]。甲狀腺癌治療通常選擇手術(shù)切除或放射碘治療,在大多數(shù)情況下,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)在手術(shù)切除后預(yù)后良好,少數(shù)患者會(huì)復(fù)發(fā)或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。探索PTC細(xì)胞遷移的潛在分子機(jī)制,對(duì)于提供新的治療靶點(diǎn)和改善PTC患者的預(yù)后具有重要意義。

miRNA在腫瘤發(fā)生中起重要作用,并顯示出明顯的組織特異性,miRNA也被認(rèn)為是良好的癌癥生物標(biāo)志物。已有研究表明miR-199a-3p在甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本中和細(xì)胞系中低表達(dá),并表現(xiàn)出抑癌作用[3]。CD151是近年新發(fā)現(xiàn)的癌基因,在多種腫瘤細(xì)胞表面均有較高水平的表達(dá),相關(guān)研究表明CD151 mRNA和蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)明顯升高[4]。但miR-199a-3p與CD151的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。miR-199a-3p與CD151在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否具有調(diào)控作用,有待進(jìn)一步探究,因此本研究以甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞為研究對(duì)象,初步探討了miR-199a-3p靶向CD151對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青-鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);miR-199a-3p mimic、mimic-NC、pcDNA載體由上海生工生物工程股份有限公司合成;BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑、二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司;Transwell購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司;一抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、Ki-67、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、actin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將B-CPAP細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中,添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素,于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24 h更換新鮮培養(yǎng)液,1∶2傳代。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)

用Trizol法從B-CPAP細(xì)胞中提取總RNA,提取的總RNA首先去除基因組中的DNA,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以上步驟根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)。以actin和U6為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)分析顯示CD151是miR-199a-3p的潛在靶點(diǎn),選用熒光素酶報(bào)告分析,構(gòu)建野生型和突變型CD151 3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至B-CPAP細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)B-CPAP細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

1.5 CD151過(guò)表達(dá)

構(gòu)建pcDNA載體的CD151過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至B-CPAP細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為3組:Control組、pcDNA-NC組和pcDNA-CD151組,通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)CD151表達(dá)量。Control組細(xì)胞不作處理,pcDNA-NC組轉(zhuǎn)染pcDNA-NC,pcDNA-CD151組轉(zhuǎn)染pcDNA-CD151。

1.6 細(xì)胞分組

將miR-199a-3p mimic與pcDNA-CD151單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染至B-CPAP細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:Control組、miR-199a-3p mimic組、pcDNA-CD151組和miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組。

1.7 BrdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B-CPAP細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),按方法1.6處理及分組。加入終濃度為0.03 μg/mL的BrdU繼續(xù)孵育40 min。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。鏡下觀察并計(jì)數(shù)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

使用Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Annexin Ⅴ-FITC(-)/ PI(-)(左下)為正常細(xì)胞,Annexin Ⅴ-FITC(+)/ PI(-)細(xì)胞(右下)為早期凋亡細(xì)胞,Annexin Ⅴ-FITC(+)/ PI(+)(右上)為晚期凋亡細(xì)胞。Annexin Ⅴ(-)/ PI(+)(左上)為壞死細(xì)胞。

1.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室加入50 μL基質(zhì)膠并于37 ℃孵育3 h凝固。將1.6所述分組處理的細(xì)胞接種于Transwell小室上室,其中上室為無(wú)血清培養(yǎng)液,下室為完全培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后擦除未穿過(guò)膜的細(xì)胞,再以多聚甲醛固定,1%結(jié)晶紫染色,200倍放大視野下拍照觀察并計(jì)數(shù)。每組取3個(gè)隨機(jī)視野,計(jì)數(shù)視野中的染色細(xì)胞數(shù)目即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.10 Western blot檢測(cè)MMP-2、Ki-67、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

按方法1.6處理各組細(xì)胞,用RIPA裂解液提取各組B-CPAP細(xì)胞蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白后每組取20 μg蛋白在10% SDS-PAGE中電泳分離蛋白,并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂乳封閉2 h,一抗(1∶1000)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS緩沖液清洗3次后加入2抗(1∶10000)繼續(xù)孵育2 h,ECL顯色液顯影,以actin為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CD151與miR-199a-3p的靶向關(guān)系

通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)得到CD151的3′-UTR有miR-199a-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖1A),提示CD151與miR-199a-3p可能存在靶向作用關(guān)系。在B-CPAP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-199a-3p與CD151 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與Control組比較,miR-199a-3p mimic組CD151 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.01,圖1B、1C)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,CD151 Wt組加入miR-199a-3p mimic處理后熒光素酶活性降低(P<0.01,圖1D)。

1:Control組;2:mimic-NC組;3:miR-199a-3p mimic組;4:CD151 Wt組;5:CD151 Wt+miR-199a-3p mimic組;6:CD151 Mut組;7:CD151 Mut+miR-199a-3p mimic組;A:Targetscan預(yù)測(cè)靶向關(guān)系;B:qRT-PCR檢測(cè)miR-199a-3p表達(dá)水平,與Control組比較,**P<0.01;C:qRT-PCR檢測(cè)CD151 mRNA的表達(dá)水平,與Control組比較,**P<0.01;D:雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系,與CD151 Wt組比較,**P<0.01圖1 CD151與miR-199a-3p的靶向關(guān)系Fig.1 Targeting relationship between CD151 and miR-199a-3p

A:膽管癌組織樣本中PTEN免疫組化染色結(jié)果(×200);B:PTEN高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的總體生存期與無(wú)病生存期分析圖1 PTEN在膽管癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Immunohistochemical staining of PTEN in clinical patients with cholangiocarcinoma and the relationship between PTEN expression and prognosis

2.2 在B-CPAP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD151

通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢驗(yàn)CD151過(guò)表達(dá)是否成功(圖2)。與Control組比較,pcDNA-CD151組CD151 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

1:Control組,2:pcDNA-NC組,3:pcDNA-CD151組;A:CD151 mRNA表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖;B:CD151蛋白表達(dá)蛋白條帶;C:半定量分析CD151蛋白表達(dá)水平;與Control組比較,**P<0.01圖2 在B-CPAP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD151Fig.2 Overexpression of CD151 in B-CPAP cells

**P<0.01圖2 三種膽管癌細(xì)胞系中PTEN蛋白的表達(dá)情況Fig.2 Expression of PTEN in cholangiocarcinoma cell lines

2.3 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151抑制B-CPAP細(xì)胞增殖

通過(guò)BrdU染色檢測(cè)B-CPAP細(xì)胞的增殖能力(圖3)。與Control組相比較,miR-199a-3p mimic組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,pcDNA-CD151組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與pcDNA-CD151組相比較,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。

A:3種膽管癌細(xì)胞系對(duì)雷公藤紅素的藥物敏感性;B:經(jīng)雷公藤紅素處理后膽管癌細(xì)胞系的形態(tài)變化,標(biāo)尺=20 μm圖3 雷公藤紅素對(duì)膽管癌細(xì)胞活力和形態(tài)的影響Fig.3 Effect of Celastrol on viability and morphology of cholangiocarcinoma cells

1:Control組,2:miR-199a-3p mimic組,3:pcDNA-CD151組,4:miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組;A:BrdU染色結(jié)果(×200);B:半定量分析各組B-CPAP細(xì)胞BrdU陽(yáng)性細(xì)胞占比,與Control組比較,**P<0.01,與pcDNA-CD151組比較,##P<0.01圖3 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of miR-199a-3p overexpression targeting CD151 on the proliferation of B-CPAP cells

2.4 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151促進(jìn)B-CPAP細(xì)胞凋亡

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B-CPAP細(xì)胞凋亡率(圖4)。與Control組比較,miR-199a-3p mimic組細(xì)胞凋亡率升高,pcDNA-CD151組細(xì)胞凋亡率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與pcDNA-CD151組比較,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組細(xì)胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A:CellTiter細(xì)胞活力檢測(cè),與對(duì)照組比較,*P<0.05 **P<0.01;B:光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察,標(biāo)尺=20 μm圖4 PTEN調(diào)控HCCC-9810細(xì)胞對(duì)雷公藤紅素的敏感性Fig.4 PTEN regulates sensitivity of HCCC-9810 cells to Celastrol

1:Control組,2:miR-199a-3p mimic組,3:pcDNA-CD151組,4:miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組;A:流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞凋亡率;B:半定量分析各組B-CPAP細(xì)胞細(xì)胞凋亡率;與Control組比較,**P<0.01;與pcDNA-CD151組比較,##P<0.01圖4 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151對(duì)B-CPAP細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of miR-199a-3p overexpression targeting CD151 on apoptosis of B-CPAP cells

2.5 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151調(diào)控B-CPAP細(xì)胞周期分布

通過(guò)流式分選檢測(cè)細(xì)胞周期(圖5)。與Control組比較,miR-199a-3p mimic組G2/M和G1期比例降低,S期比例升高,pcDNA-CD151組G2/M和G1期比例升高,S期比例降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與pcDNA-CD151組比較,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組G2/M和G1期比例降低,S期比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

CC1:原代人膽管癌細(xì)胞1,CC2原代人膽管癌細(xì)胞2;A:Western blot檢測(cè)PDCs中PTEN表達(dá);B:CellTiter檢測(cè)細(xì)胞活力,與CCT1比較,**P<0.01圖5 PTEN表達(dá)/缺失的PDCs對(duì)雷公藤紅素的敏感性Fig.5 Sensitivity of PTEN-positive or PTEN-negative PDCs to Celastrol

1:Control組;2:miR-199a-3p mimic組;3:pcDNA-CD151組;4:miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組圖5 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151對(duì)B-CPAP細(xì)胞周期分布的影響Fig.5 The effect of miR-199a-3p overexpression targeting CD151 on the cell cycle distribution of B-CPAP cells

2.6 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151降低B-CPAP細(xì)胞侵襲能力

通過(guò)Transwell檢測(cè)B-CPAP細(xì)胞侵襲能力(圖6)。與Control組比較,miR-199a-3p mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)減少,pcDNA-CD151組侵襲細(xì)胞數(shù)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與pcDNA-CD151組比較,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組侵襲細(xì)胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

1:Control組,2:miR-199a-3p mimic組,3:pcDNA-CD151組,4:miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組;A:Transwell檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)(×200);B:半定量分析各組B-CPAP細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù),與Control組比較,**P<0.01,與pcDNA-CD151組比較,##P<0.01圖6 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151對(duì)B-CPAP細(xì)胞侵襲的影響Fig.6 The effect of miR-199a-3p overexpression on the invasion of B-CPAP cells

2.7 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151降低B-CPAP細(xì)胞MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá)

通過(guò)Western blot檢測(cè)B-CPAP細(xì)胞MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá)(圖7)。與Control組比較,miR-199a-3p mimic組MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá)降低,pcDNA-CD151組MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與pcDNA-CD151組比較,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

1:Control組,2:miR-199a-3p mimic組,3:pcDNA-CD151組,4:miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組;A:Western blot檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá);B:半定量分析各組B-CPAP細(xì)胞MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá),與Control組比較,**P<0.01,與pcDNA-CD151組比較,##P<0.01圖7 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151對(duì)B-CPAP細(xì)胞MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of miR-199a-3p overexpression targeting CD151 on the protein expressions of MMP-2,Ki-67 and Cyclin D1 in B-CPAP cells

2.8 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151升高E-cadherin蛋白表達(dá),降低N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

通過(guò)Western blot檢測(cè)B-CPAP細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)(圖8)。與Control組比較,miR-199a-3p mimic組E-cadherin蛋白表達(dá)升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)降低,pcDNA-CD151組E-cadherin蛋白表達(dá)降低,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與pcDNA-CD151組比較,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組E-cadherin蛋白表達(dá)升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

1:Control組,2:miR-199a-3p mimic組,3:pcDNA-CD151組,4:miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151組;A:Western blot檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá);B:半定量分析各組B-CPAP細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá);與Control組比較,**P<0.01;與pcDNA-CD151組比較,##P<0.01圖8 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151對(duì)B-CPAP細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of miR-199a-3p overexpression targeting CD151 on the protein expressions of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin in B-CPAP cells

3 討論

近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明miRNA通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生理功能在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,為甲狀腺癌的診斷與治療提供了新的研究方向[5]。在本研究中,生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)CD151是miR-199a-3p的靶基因。CD151參與腫瘤組織間肌動(dòng)蛋白骨架重排,與甲狀腺乳頭狀癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。

細(xì)胞異常增殖是癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要組成部分,Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原,參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲,其在甲狀腺癌中高表達(dá)[8]。細(xì)胞周期阻滯是細(xì)胞分化過(guò)程中的必要事件,Cyclin D1作為調(diào)控細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)的主要組成部分,具有滅活Rb的作用,并協(xié)同CDK發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用,使之從G1期進(jìn)展為S期。Cyclin D1蛋白高表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,且可能引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[9]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151,降低G2/M、G1期比例和Cyclin D1、Ki-67蛋白表達(dá),升高S期比例。提示miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151通過(guò)調(diào)控周期分布抑制B-CPAP細(xì)胞增殖。

本研究通過(guò)流式和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151升高B-CPAP細(xì)胞凋亡率,降低侵襲細(xì)胞數(shù)。MMP-2異常高表達(dá)是甲狀腺癌發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。miR-199a-3p與多種惡性腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、凋亡和侵襲密切相關(guān)。邢曉偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-199a-3p可抑制mTOR的表達(dá)引起骨肉瘤細(xì)胞自噬從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡降低細(xì)胞增殖。張麗娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可能通過(guò)抑制c-Met、MMP-2和CD44蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響卵巢癌SK0V3細(xì)胞的侵襲和遷移。提示miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151可誘導(dǎo)B-CPAP細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞侵襲。

本研究通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151升高B-CPAP細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá),降低N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中,EMT起著關(guān)鍵的作用,通過(guò)EMT,腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞粘附和極性,獲得間葉細(xì)胞的特性,包括遷移、侵襲及干樣特性[13]。在正常上皮組織中,E-cadherin可以維持緊密的細(xì)胞連接,限制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移,而N-cadherin主要分布在神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞間葉組織,與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力有關(guān)[14]。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞中的中間纖維,與微絲和微管共同構(gòu)成了細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò),負(fù)責(zé)維持細(xì)胞骨架的完整性[15-16]。EMT的主要特點(diǎn)是E-cadherin高表達(dá)和N-cadherin及Vimentin的過(guò)表達(dá)[17]。表明miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向CD151抑制B-CPAP細(xì)胞EMT。

綜上所述,miR-199a-3p過(guò)表達(dá)可抑制B-CPAP細(xì)胞增殖、侵襲和EMT,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-199a-3p能夠靶向結(jié)合CD151,并可負(fù)向調(diào)控CD151的表達(dá),CD151過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-199a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和EMT的作用效應(yīng)。探討miR-199a-3p及CD151之間的調(diào)控關(guān)系有望成為臨床治療甲狀腺癌的新靶點(diǎn)。