郭靖,張麗,王紀(jì)清,白文軒

(衡水學(xué)院 化工學(xué)院,河北 衡水 053000)

款冬花(FarfaraeFlos)又名款花、九九花,俗稱連三朵,是菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾,其性辛、溫、味微苦,歸肺經(jīng),具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰之功效,常用于治療新舊咳嗽、喘咳痰多和勞嗽咳血等病癥[1]?，F(xiàn)代研究表明款冬花主要含有黃酮類、萜類、有機(jī)酸類、生物堿類、多糖類、揮發(fā)油類等生物活性成分[2],具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[3]。黃酮類化合物具有優(yōu)良的抗炎、抗氧化作用,在食品、藥品、化妝品領(lǐng)域具有極廣泛的應(yīng)用。劉彩紅等[4]研究結(jié)果表明款冬花中的黃酮化合物對(duì)自由基有較好的清除作用,可作為潛在的抗氧化活性的天然產(chǎn)物。本文以款冬花為原料,利用響應(yīng)面Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)對(duì)其總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,通過回歸方程探究最優(yōu)提取工藝條件,并研究影響因素對(duì)款冬花總黃酮含量的交互作用,以期為溶劑浸提款冬花總黃酮的產(chǎn)業(yè)化研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

722紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)、 恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)、Re-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器公司)、蘆丁(中國(guó)藥品生物制品檢定所)、硝酸鋁(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、亞硝酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)、無水乙醇(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠,分析純);款冬花(購于安徽亳州市佰林堂藥業(yè)有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取0.1 mg/mL蘆丁溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL分別于10 mL容量瓶中,分別加入0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液,3 min后加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液,靜置6 min后加入4 mL的10%氫氧化鈉溶液,用蒸餾水定容,搖勻放置15 min后于最大吸收波長(zhǎng)507 nm處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),擬合得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.970 9x+0.012 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1,范圍為 0～50 μg/mL。

1.2.2 款冬花總黃酮的含量測(cè)定

精確稱取款冬花1.00 g,加入一定濃度的乙醇溶液,在一定溫度和料液比下,加熱回流一段時(shí)間,過濾得濾液,將濾液定容至一定量體積。取一定體積樣品溶液稀釋后,按1.2.1法測(cè)定吸光度,根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算款冬花的總黃酮含量(mg/g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

精確稱量1.00 g款冬花,采用乙醇回流浸提法,分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù) (50%,60%,70%,80%,90%)、料液比1∶25,1∶30,1∶35,1∶40,1∶45(g∶mL)、提取時(shí)間 (60,90,120,150,180 min)、提取溫度 (50,60,70,80,90 ℃)四個(gè)變量對(duì)款冬花總黃酮的提取含量影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,篩選出款冬花總黃酮含量影響較大的三個(gè)因素,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)共29組,以款冬花的總黃酮含量為響應(yīng)指標(biāo),探討各變量及其相互作用對(duì)提取總黃酮含量的影響。表1顯示中心組合設(shè)計(jì)各變量水平。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)總黃酮含量的影響

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

從圖1可知,隨乙醇濃度的增加,款冬花總黃酮含量先升后降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,總黃酮含量最高為50.10 mg/g?？赡苁怯捎谝掖俭w積分?jǐn)?shù)增加,黃酮類化合物在醇溶液中溶解增大,60%醇溶液使黃酮溶解度達(dá)最大,隨乙醇濃度繼續(xù)增加,醇溶性雜質(zhì)溶出量增大,與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶出,使總黃酮類化合物含量降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%范圍內(nèi)比較合適。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

由圖2可知,提取溫度與款冬花總黃酮含量成正相關(guān),當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)達(dá)最高值49.90 mg/g。繼續(xù)升溫至90 ℃時(shí),總黃酮含量卻略有降低,原因可能是由于高溫導(dǎo)致熱敏性黃酮化合物降解,從而使總黃酮含量降低。故提取溫度選擇70～90 ℃為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)范圍。

圖2 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

由圖3分析可知,隨提取時(shí)間的增加,款冬花總黃酮含量先升后降。當(dāng)提取時(shí)間150 min時(shí),款冬花總黃酮含量達(dá)最高,為49.57 mg/g。因此優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間范圍為120～180 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

2.1.4 液料比對(duì)總黃酮含量的影響

由圖4可知,當(dāng)料液比處于 1∶40 mL/g 時(shí),款冬花總黃酮含量達(dá)到峰值,液料比繼續(xù)增大,總黃酮含量開始降低?？赡艿脑蚴钱?dāng)溶劑量過小時(shí),較少的提取溶劑不能夠?qū)⒖疃ㄍ耆?總黃酮溶出不徹底; 隨著液料比的增加,總黃酮開始溶出徹底,總黃酮含量迅速增加。當(dāng)溶劑量過多時(shí),款冬花的其他溶質(zhì)開始析出,款冬花中總黃酮含量減少了。故將液料比在 1∶35～1∶45(g∶mL)作為優(yōu)化試驗(yàn)的范圍。

圖4 液料比對(duì)總黃酮含量的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2.1 回歸方程擬合

Design-Expert 12.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析,得到二次回歸模型擬合及方差分析見表3。

表3 方差分析表

款冬花總黃酮含量=50.70+1.23A+1.19B+0.7083C+1.34D+1.39AB+0.5090AC+1.18AD-0.7225BC+1.71BD+0.5175CD-5.05A2-3.31B2-5.31C2-5.13D2。

由方差分析可知,乙醇濃度、料液比和提取溫度的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)對(duì)款冬花總黃酮的提取均達(dá)到了極度顯著水平(P<0.01);料液比和提取溫度的交互效應(yīng)對(duì)款冬花黃酮含量的影響達(dá)到了極顯著水平(P<0.01);提取時(shí)間的一次項(xiàng)、乙醇濃度與料液比及乙醇濃度與提取溫度的交互作用對(duì)總黃酮提取影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05),提取時(shí)間與其余因素的兩兩交互項(xiàng)均為不顯著。根據(jù)回歸方程系數(shù)及方差表可知,四個(gè)變量中對(duì)款冬花總黃酮含量(Y)影響最大的是提取溫度(D),其次為乙醇濃度(A),料液比(B),而提取時(shí)間(C)對(duì)總黃酮含量影響最小。

2.2.2 響應(yīng)面分析

兩兩交互效應(yīng)對(duì)款冬花總黃酮提取含量影響的響應(yīng)面及其等高線如圖5～7所示。等高線圖表示在同一橢圓曲線上,款冬花總黃酮的含量是相同的。響應(yīng)面坡度越陡峭,相應(yīng)的等高線排列越密,說明該坐標(biāo)軸因素變化對(duì)款冬花總黃酮含量影響越大。相反響應(yīng)曲面坡度越緩,等高線排列越稀,則該因素條件變化對(duì)響應(yīng)值的影響也越小。等高線的形狀也可體現(xiàn)因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,形狀越趨向橢圓或橢圓軸線與坐標(biāo)軸間角度越大,表明因素間的交互效應(yīng)越顯著,對(duì)提取款冬花總黃酮含量的影響越大。反之等高線形狀越接近圓形或橢圓軸線與坐標(biāo)軸角度越小,則表明因素間的交互效應(yīng)比較弱,對(duì)款冬花總黃酮含量的影響較小。

圖5 提取溫度和料液比交互作用的響應(yīng)曲面及等高線

分析圖5等高線圖,提取溫度的等高線比料液比排列緊密,表明提取溫度的主效應(yīng)大于料液比。圖5中等高線與圖6、圖7比較,更趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸角度更大,表明提取溫度和料液的交互作用要明顯強(qiáng)于圖6和圖7中兩兩交互效果。驗(yàn)證了方差顯著性檢驗(yàn)中,BD交互效果極顯著,而AB、AD交互作用顯著的結(jié)果。

圖6 乙醇濃度和料液比交互作用的響應(yīng)曲面及等高線

圖7 提取溫度和乙醇濃度交互作用的響應(yīng)曲面及等高線

2.3 優(yōu)化提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化款冬花總黃酮含量的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)61.81%,提取時(shí)間152.06 min,提取溫度81.96 ℃,料液比為1∶41.34(g∶mL),款冬花總黃酮含量的預(yù)測(cè)值51.13 mg/g?？紤]實(shí)際限制,對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行調(diào)整:乙醇體積分?jǐn)?shù)62%,提取時(shí)間152 min,提取溫度82 ℃,料液比1∶41(g∶mL),進(jìn)行款冬花總黃酮提取,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,實(shí)際款冬花總黃酮含量為50.11 mg/g,為模型理論預(yù)測(cè)值的98%,與模型預(yù)測(cè)值高度相符。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.54%,說明此方法測(cè)得款冬花總黃酮含量的精密度較高。故采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的款冬花總黃酮提取工藝穩(wěn)定,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,可用于提取款冬花總黃酮的大規(guī)模生產(chǎn)。

3 結(jié)論

依據(jù)響應(yīng)面法得到的回歸模型探討得到最佳的工藝條件為: 提取溫度82 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)62%,提取時(shí)間152 min,料液比1∶41(g∶mL),款冬花總黃酮含量可達(dá)50.11 mg/g,理論含量為51.13 mg/g?；貧w模型擬合度高。優(yōu)化了款冬花總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明,此工藝條件良好可行,能夠?yàn)榭疃傸S酮在醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。