杜非凡 陳星宇 李 碩 張 昊 常怡悅 張自瑞 閆衛(wèi)疆 肖 非 孫雪梅 盛金良 孫延鳴* 張彥兵,*

（1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2 新疆泰昆集團股份有限公司，新疆昌吉 831203）

miRNA（microRNA）是一類長約19～25 nt 的非編碼RNA，具有較高的保守性[1,2]。一般miRNA 的成熟需要經(jīng)過3 個階段：在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄得到pri-miRNA、由RNase Ⅲ-Drosha 酶剪切得到pre-miRNA、由premiRNA 運轉(zhuǎn)出核進入胞漿內(nèi)并成熟[3-7]。含有miRNA 引導(dǎo)鏈的RISC 與靶mRNA 的3’UTR 不完全互補配對時會阻礙靶蛋白的翻譯，從而抑制目的基因的表達(dá)；miRNA 與靶mRNA 發(fā)生完全互補配對時，靶mRNA 則被AGO2 蛋白降解[8]。由于miRNA 序列、結(jié)構(gòu)多樣，其在生物調(diào)控及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮著重要作用，包括病毒細(xì)胞的增殖與凋亡、癌癥治療等方面[9,10]。

金銀花是一種重要的藥用植物，因為具有多種生物活性，所以在生理上主要有解熱、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，其作為中藥材被廣泛應(yīng)用于治療流感病毒等方面[11]。2015 年Zhou 等[12]發(fā)現(xiàn)灌服金銀花湯后的小鼠體內(nèi)miR2911 豐度較高。由于miR2911 的功能在于能夠靶向多種甲型流感病毒（IAVs），所以化學(xué)合成的miR2911不但可以顯著抑制H1N1 的PB2 和SN1 蛋白的表達(dá)，而且還能降低H5N1 感染小鼠的死亡率。最新研究顯示，miR2911 可有效抑制SARS-CoV-2（新型冠狀病毒）的復(fù)制，并且miR2911 在SARS-CoV-2 基因區(qū)域存在多個抑制靶點[13]，因此，猜測金銀花miR2911 可能具有較廣泛的抗病毒作用。

非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種雙鏈DNA 病毒，屬于非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae） 非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）。ASFV 病毒粒子直徑一般可達(dá)260～300 nm，其基因組長度介于170～193 kb，可編碼150～167 個蛋白。并且ASFV 是一種烈性病毒，急性期ASFV 可引起豬100%的死亡率，感染ASFV 的病豬癥狀包括嗜睡、血性腹瀉、高熱、血管變化等[14,15]。目前已研發(fā)出的非洲豬瘟滅活疫苗無法完全誘導(dǎo)生豬機體產(chǎn)生中和抗體，且效果不佳，而基因缺失疫苗正在研發(fā)中。因此，針對非洲豬瘟病毒缺乏有效的治療手段，仍需要以防控為主。

鑒于miR2911 具有強大的抗病毒功效，本文通過生物信息學(xué)等方法，探討金銀花源miR2911 對ASFV 相關(guān)基因靶向區(qū)域，以期為研發(fā)抗ASFV 感染的藥物提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 金銀花miR2911 序列獲得

在miRbase（http://www.mirbase.org/index.shtml）數(shù)據(jù)庫中，下載金銀花源miR2911 的成熟序列，5’-GGCCGGGGGACGGACUGGGA-3’。

1.2 ASFV 全基因序列下載

進入NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 數(shù)據(jù)庫，搜索ASFV 的全基因組序列，下載我國當(dāng)前非洲豬瘟病毒流行毒株的全基因組序列。

1.3 miRNA 靶向ASFV 基因區(qū)域預(yù)測

在windows 環(huán)境下，打開網(wǎng)頁版本的miRanda 軟件（http://www.bioinformatics.com.cn/local_miranda_m iRNA_target_prediction_120），在操作界面輸入miRNA序列和ASFV 全基因組序列，點擊分析，則會運行程序顯示分析結(jié)果。

1.4 靶向區(qū)域進化樹構(gòu)建

在構(gòu)建miR2911 靶向ASFV 基因區(qū)域進化樹時，先將每個病毒被靶向區(qū)域與其他流行毒株進行比對，從而獲取不同毒株相應(yīng)靶向區(qū)域。每個毒株被靶向區(qū)域按照一定順序拼到一起，1 個毒株作為1 個整體的基因序列，利用MAGE7 軟件，按照臨近法構(gòu)建進化樹，相當(dāng)于多基因法構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR2911 靶向ASFV 基因區(qū)域預(yù)測

利用miRanda 軟件預(yù)測，首先，將miR2911 分別靶向ASFV 的NP1450L 基因、GL1340L 基因、MGF_110-5L-6L 基因及EP1242L 基因等4 個基因的2 個區(qū)域，其中對NP1450L 基因130 231～130 255 區(qū)域的靶向性較好，其分值為108 分，自由能（Energy）為-35.37 kCal/Mol。其次，miR2911 對ASFV 的G1340L 基因的112 860～112 881 區(qū)域靶向時，其分值可以達(dá)到102分，自由能（Energy） 為-25.40 kCal/Mol；在靶向ASFV 的EP1242L 基因的2 個區(qū)域（69 000～69 022 和67 435～674 54）時，區(qū)域69 000～69 022 的靶向性相對較高，其分值可達(dá)99 分，自由能可達(dá)到-32.02 kCal/Mol；靶向ASFV 的MGF_110-5L-6L 基因的10 218～10 237 區(qū)域，其分值為93 分，自由能為-23.81 kCal/Mol。綜合miR2911 靶向AFSV 的4 個基因的各項數(shù)據(jù)，表明miR2911 具有潛在抑制AFSV 中NP1450L基因和ASFV G1340L 基因復(fù)制的能力（圖1）。

圖1 miR2911 靶向ASFV 基因分析結(jié)果

2.2 miR2911 靶向ASFV 基因區(qū)域序列進化樹分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中，下載miR2911 靶向ASFV 基因區(qū)域序列，將多個區(qū)域按先后串聯(lián)，利用MEGA 7.0 軟件中鄰近法構(gòu)建miR2911 靶向病毒基因區(qū)域進化樹，miR2911 靶向ASFV 的基因區(qū)域100%同源（圖2）。

圖2 miR2911 靶向ASFV 基因多區(qū)域序列進化樹

3 討論

金銀花性甘、寒，具有多種生物活性，可起到清熱解毒，消炎退腫的作用；金銀花與其他中藥配伍后可預(yù)防和治療病毒性感染。據(jù)報道，金銀花源miR2911 通過與病毒特定基因序列的相互作用，可以有效抑制病毒的復(fù)制，在抗病毒方面發(fā)揮著重要作用。在畜禽養(yǎng)殖過程中，抗病毒感染與治療是當(dāng)前全球范圍內(nèi)探討的一個熱點話題。研究表明，miR2911 性質(zhì)穩(wěn)定，經(jīng)口服可被動物體吸收。鑒于miR2911 的抗病毒作用，以miR2911為研究對象，通過應(yīng)用miRanda 軟件分析miR2911 靶向ASFV 基因的具體區(qū)域、分值及自由能的高低，從而進一步分析miR2911 靶向病毒區(qū)域的保守性，以期為治療豬病毒性傳染病提供借鑒。

自2018 年非洲豬瘟疫情在我國發(fā)生以來，豬主要病毒性傳染病防控形勢愈發(fā)嚴(yán)峻，“老病未滅，新病又起”是我國目前養(yǎng)豬業(yè)面臨的主要問題。目前病毒性傳染病往往需要免疫疫苗進行防控，還沒有特效治療藥物。經(jīng)研究考慮到金銀花源miR2911 在抵抗流感病毒感染和新型冠狀病毒感染時發(fā)揮的中藥作用，猜測金銀花miR2911 可能在ASFV 基因上存在潛在的靶向位點，并利用miRanda 軟件成功預(yù)測了miR2911 在ASFV 基因上的靶向位點。由于miR2911 在豬病毒基因上的靶向區(qū)域很多，所以將得分低于82 分的全舍棄。miR2911 可靶向ASFV 的4 個基因，其中在ASFV 的EP1242L 基因上有2 個靶向區(qū)域。

非洲豬瘟病毒中的NP1450L、EP1242L 和MGF_110-5L-6L 等3 個基因在病毒感染生豬過程中發(fā)揮重要作用。NP1450L 蛋白與RNA 聚合酶的最大亞基具有廣泛的相似性。而EP1242L 蛋白類似于第2 大RNA 聚合酶亞基。NP1450L 蛋白和EP1242L 與真核RNA 聚合酶Ⅱ的亞基更相似；NP1450L 和EP1242L 主要在非洲豬瘟病毒感染晚期開始表達(dá)。外源表達(dá)MGF110-5L-6L蛋白還可誘導(dǎo)高爾基體和過氧化物酶體的亞細(xì)胞定位與形態(tài)發(fā)生顯著改變，認(rèn)為MGF110-5L-6L 蛋白可能通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)分泌途徑及相關(guān)膜性細(xì)胞器發(fā)生等，而打破細(xì)胞的正常生理功能穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致豬只發(fā)病。已證實外源表達(dá)MGF110-5L-6L蛋白可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，并通過活化PERK 和PKR 激酶觸發(fā)e IF2α 的磷酸化，進而誘發(fā)綜合應(yīng)激反應(yīng)，致使豬機體的細(xì)胞蛋白翻譯阻滯以及應(yīng)激顆粒產(chǎn)生。

miR2911 在非洲豬瘟病毒基因中的靶點非常保守，不同時期和不同地區(qū)的非洲豬瘟病毒分離毒株的靶點同源性很高。因此，金銀花源miR2911 具有潛在抑制當(dāng)前非洲豬瘟病毒流行毒株復(fù)制的作用。下一步，將與其他實驗室合作，構(gòu)建miR2911 過表達(dá)質(zhì)粒，在細(xì)胞水平驗證miR2911 抑制上述病毒復(fù)制的能力；在此基礎(chǔ)上，進一步將miR2911 導(dǎo)入酵母菌、馬鈴薯、番茄、苜蓿等植物中，通過給豬只飼喂上述轉(zhuǎn)基因菌株的植物，提高豬抗病毒的能力。并通過檢測豬只排毒情況和病理損傷程度，在動物體內(nèi)開展miR2911 抗病毒感染作用。

4 結(jié)論

本試驗通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了miR2911 對非洲豬瘟病毒關(guān)鍵基因的靶向性并對此展開分析。miR2911可較好地靶向非洲豬瘟病毒的NP1450L 基因，顯示出miR2911 潛在抑制非洲豬瘟病毒復(fù)制的能力。根據(jù)遺傳進化樹結(jié)果顯示miR2911 在非洲豬瘟病毒基因上的靶向區(qū)域100%同源，表明miR2911 具有靶向不同流行非洲豬瘟病毒毒株的能力。綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)miR2911 對于非洲豬瘟病毒具有潛在抑制作用，為進一步探索其抑制原理及相關(guān)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。