王傳鋒 米青婕 皮志媛

（伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000）

豬瘟的防控主要依靠疫苗免疫，但豬瘟疫苗在臨床使用過(guò)程中常常出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。研究表明，這與外源病毒的干擾有關(guān)，其中BVDV 的干擾是豬瘟疫苗免疫失敗的重要原因之一。BVDV 自然感染豬會(huì)出現(xiàn)類似豬瘟的臨床癥狀，主要包括仔豬生長(zhǎng)發(fā)育不良、僵豬、貧血、結(jié)膜炎和腹瀉等。豬感染BVDV 后表現(xiàn)出的具體臨床癥狀和病理變化也不盡相同，如仔豬先天性感染BVDV 可產(chǎn)生抗體，也可發(fā)展為持續(xù)性感染，并在感染后數(shù)天內(nèi)死亡；母豬自然感染BVDV 后可出現(xiàn)受孕率降低、流產(chǎn)和產(chǎn)死胎等現(xiàn)象；肥豬感染BVDV 后主要以慢性胃腸炎和敗血癥為特征，類似于慢性豬瘟。BVDV 廣泛存在于胎牛血清中，豬瘟疫苗的研制不可或缺的要使用胎牛血清，若使用了被BVDV 污染的胎牛血清，則該病毒會(huì)大幅降低豬瘟疫苗的免疫質(zhì)量，導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失敗。因此，檢測(cè)胎牛血清和豬瘟疫苗中是否存在BVDV污染意義重大。本文采用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）方法對(duì)伊犁河谷市售豬瘟疫苗和胎牛血清進(jìn)行BVDV 檢測(cè)，以期為養(yǎng)豬企業(yè)選擇豬瘟疫苗提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNA 提取試劑盒和熒光定量PCR 試劑均購(gòu)自大連寶生物公司；CFX96 熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司。低溫高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。渦旋振蕩器購(gòu)自深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 豬瘟疫苗和胎牛血清

新疆伊犁河谷地區(qū)市面所售的來(lái)自不同廠家的豬瘟疫苗和胎牛血清，具體信息見(jiàn)表1。

表1 待檢生物制劑樣品信息

1.3 引物合成

參照陳其兵等[1]合成引物及探針的方法，設(shè)計(jì)熒光定量所需引物及探針，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物PF 5’-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGT GG-3’

下游引物PR 5’-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3’

熒光探針PB 5’FAM-AGATGCCACGTGGACGAG GGC-BHQ1 3’

1.4 RNA 的提取

取稀釋后的豬瘟疫苗250 μL 加入750 μL Trizol，振蕩混勻后室溫放置5 min，再加入氯仿溶液250 μL，充分振蕩混勻后室溫放置10 min，4℃12 000 rpm 離心15 min，取500 μL 上清液，加入等量的異丙醇溶液混勻，靜置30 min 后，4℃12 000 rpm 離心10 min，棄去上清，用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀物，4℃12 000 rpm 離心5 min 棄去上清，將離心管在室溫下靜置干燥20 min，然后加入30 μL ddH20，充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量RT-PCR

反應(yīng)體系為：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10 μL，10 μM TaqMan 探針0.4 μL，10 μM 上游引物0.4 μL，10 μM 下游引物0.4 μL、TaKaRa ExTaq HS 0.4 μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ0.4 μL、Rox Reference Dye 0.4 μL、DEPC H2O 5.6 μL、模板2 μL。

反應(yīng)條件為: 42℃5 min，95℃10 s；95℃5 s，60℃40 s（收集熒光FAM，40 個(gè)循環(huán)）。

2 結(jié)果與分析

對(duì)來(lái)自伊犁河谷地區(qū)市場(chǎng)上銷售的11 份豬瘟疫苗和12 份胎牛血清進(jìn)行BVDV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，豬瘟疫苗中共檢出2 份BVDV 陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為18.2%，陽(yáng)性樣本均為細(xì)胞源豬瘟疫苗，分別來(lái)自于國(guó)內(nèi)疫苗生產(chǎn)廠家B 和E。胎牛血清檢出1份BVDV 陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為8.3%，陽(yáng)性樣本為H 生產(chǎn)廠家H-1 批號(hào)樣品，具體見(jiàn)表2。

表2 伊犁河谷地區(qū)市售生物制劑樣品中BVDV 感染情況檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 BVDV 感染對(duì)豬瘟疫苗的免疫干擾

在國(guó)內(nèi)豬瘟弱毒疫苗中，時(shí)常有豬瘟疫苗被外源病原污染的報(bào)道，且污染源常為牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）和支原體[2]。牛病毒性腹瀉病毒自首次被報(bào)道以來(lái)，在全世界很多畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家中流行[3]，如澳大利亞、德國(guó)等國(guó)家的豬群中BVDV 抗體陽(yáng)性率達(dá)3%～40%，荷蘭達(dá)15%～20%。各種年齡的牛都可感染牛病毒性腹瀉病毒，以幼齡牛易感性最高，在垂直傳播后，會(huì)產(chǎn)生病毒血癥[4]。

受BVDV 感染的豬瘟疫苗，往往會(huì)導(dǎo)致豬瘟免疫失敗。主要原因是BVDV 可以對(duì)豬瘟疫苗的免疫產(chǎn)生干擾，不僅能抑制豬瘟抗體的產(chǎn)生，而且還可以刺激豬體產(chǎn)生大量的BVDV 抗體。因此，在生產(chǎn)過(guò)程中豬場(chǎng)內(nèi)豬瘟抗體明明很高，但卻依然時(shí)有豬瘟的發(fā)生，究其原因是在檢測(cè)的抗體中，豬瘟保護(hù)抗體很少，大部分可能為BVDV 抗體[5]。

3.2 BVDV 存在于胎牛血清中造成豬瘟弱毒疫苗的污染

目前，我國(guó)規(guī)?；?chǎng)中牛病毒性腹瀉病毒的感染率很高，很多地方對(duì)該病還未引起足夠重視。陶潔等[6]于2017—2020 年間對(duì)上海不同區(qū)豬場(chǎng)的血液樣品，利用多重RT-PCR 方法進(jìn)行BVDV 檢測(cè)與分析。結(jié)果表明，上海地區(qū)豬群BVDV 的總體檢出率為7.14%，且呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)。筆者曾調(diào)查過(guò)伊犁地區(qū)規(guī)?；?chǎng)BVDV 的感染率，個(gè)別牛場(chǎng)的感染率高達(dá)90%以上。胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)的重要原料，以含BVDV 的血清作為原料時(shí)，就會(huì)污染所制備的生物制品[7]，如豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)使用到牛睪丸細(xì)胞及胎牛血清，在豬繁殖與呼吸綜合癥（藍(lán)耳病）疫苗生產(chǎn)工藝的傳代細(xì)胞培養(yǎng)中也會(huì)使用到胎牛血清，如果胎牛血清中含有BVDV 病原或抗體，會(huì)使豬瘟細(xì)胞苗和豬藍(lán)耳病疫苗遭到污染[8]。溫樹(shù)波等[9]從進(jìn)口胎牛血清中成功分離到1 株非致細(xì)胞病變型BVDV 1b 亞型毒株。李艷萍等[10]從商品化的胎牛血清中分離到1 株致細(xì)胞病變（CP） 型BVDV（GS2018 株）。張超等[11]從進(jìn)口胎牛血清中分離出1 株BVDV-2 型非致細(xì)胞病變毒株，從脫脂奶粉中檢測(cè)到BVDV 抗體，表明進(jìn)口胎牛血清和脫脂奶粉中都存在BVDV 抗原和抗體污染。鞠厚斌[12]等對(duì)國(guó)內(nèi)市售的胎牛血清進(jìn)行熒光RT-PCR 檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒。結(jié)果顯示，胎牛血清BVDV 核酸陽(yáng)性率為50%。劉陽(yáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)豬瘟脾淋苗與細(xì)胞苗都能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)劑量還是加大劑量，細(xì)胞苗的免疫效果都優(yōu)于脾淋苗。

細(xì)胞苗的廣泛使用，一定程度上增加了豬瘟疫苗被BVDV 污染的風(fēng)險(xiǎn)。這給疫苗的使用和推廣帶來(lái)了很多潛在的風(fēng)險(xiǎn)，使用無(wú)BVDV 污染并且無(wú)BVDV 抗體的牛供應(yīng)細(xì)胞和血清是生產(chǎn)高安全性豬瘟疫苗的關(guān)鍵。加強(qiáng)對(duì)疫苗等生物制劑的制作工序及生產(chǎn)原料的監(jiān)管，是企業(yè)和政府職能部門當(dāng)務(wù)之急的重要工作，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。

3.3 改善弱毒疫苗生產(chǎn)工藝，有效防范外源性感染

改進(jìn)弱毒疫苗等生物制劑的生產(chǎn)工藝，也是當(dāng)前破解疫苗中BVDV 污染現(xiàn)狀的一個(gè)有效途徑。目前，有疫苗生產(chǎn)企業(yè)在使用放射性鈷-60 對(duì)血清等進(jìn)行輻射操作，以期殺滅血清中的BVDV；也有一些生物制劑廠家在研究無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，避免因原料污染而導(dǎo)致疫苗出現(xiàn)問(wèn)題；還有企業(yè)在研究胎牛血清替代品，如馬血清等。

3.4 分子生物學(xué)方法能有效檢測(cè)BVDV

建立特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高的檢測(cè)方法是篩查豬瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒污染的關(guān)鍵。于新友等[14]建立的雙重?zé)晒釶CR 方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密性好，可用于豬用疫苗中外源病毒的快速檢測(cè)及豬用疫苗等生物制品的質(zhì)量控制。本文利用已成熟的BVDV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品送第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)復(fù)檢，結(jié)果相似度100%。檢測(cè)結(jié)果表明，伊犁河谷市售的豬瘟疫苗和胎牛血清存在BVDV 的污染，這為伊犁河谷市規(guī)?；i場(chǎng)選擇安全性高的生物疫苗提供了依據(jù)。但同時(shí)疫苗中RT-PCR 檢測(cè)BVDV 也存在一定問(wèn)題，若疫苗中存在滅活的少量BVDV 也能被檢測(cè)到，因此，檢測(cè)到的病毒有可能是滅活的BVDV。如何在有限的時(shí)間內(nèi)區(qū)分BVDV 的活性，是值得學(xué)者研究的方向。

4 小結(jié)

目前，新疆部分地區(qū)大型規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟抗體合格率普遍高于中、小型規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)，說(shuō)明大型規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)在豬瘟的防控方面具有一定優(yōu)勢(shì)[15]，中小規(guī)模豬場(chǎng)還存在一定的豬瘟野毒感染風(fēng)險(xiǎn)。伊犁地區(qū)的生豬存欄量較大，且以中小型規(guī)模豬場(chǎng)為主，每年豬用疫苗的使用量相當(dāng)大，這也使很多疫苗生產(chǎn)廠家為了搶占伊犁生豬市場(chǎng)，打價(jià)格戰(zhàn)造成疫苗質(zhì)量得不到保障。伊犁河谷市所售的豬瘟疫苗種類繁多，豬場(chǎng)使用疫苗后，生豬時(shí)常出現(xiàn)類似豬瘟的臨床表現(xiàn)，這也提示養(yǎng)殖企業(yè)要加強(qiáng)對(duì)豬源BVDV 的檢測(cè)，為伊犁地區(qū)生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供保障。