吳麗艷 王 楊 曾容愚 韓金鳳 戴 琦

（1 佳和農(nóng)牧股份有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410000；2 天康生物制藥有限公司，江蘇蘇州 215028）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，因其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入須申報(bào)的動(dòng)物疫病目錄，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病[1,2]。豬瘟對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害主要表現(xiàn)在以下4 方面，一是造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；二是阻礙養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，挫傷養(yǎng)豬生產(chǎn)者的積極性；三是造成母豬帶毒綜合癥和先天感染仔豬，嚴(yán)重影響母豬的繁殖性能和育肥豬的生產(chǎn)性能，降低飼料報(bào)酬、延遲上市時(shí)間，影響種豬和豬肉銷(xiāo)售；四是造成豬只出現(xiàn)免疫抑制和免疫耐受，嚴(yán)重影響豬群健康水平，增加其他豬病防控難度等[3-6]。由于豬瘟對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害較大，因此，被定義為豬場(chǎng)中需要防控的最重要的疫病之一[7]。

動(dòng)物疫病凈化是經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外實(shí)踐證明了的非常有效的疫病消滅方法[8]，歐盟于20 世紀(jì)80 年代開(kāi)始實(shí)施豬瘟凈化項(xiàng)目，主要是通過(guò)采用C 株疫苗免疫，降低感染率，然后再采取非免疫和撲殺策略，并通過(guò)限制生豬及豬產(chǎn)品的流通，從而使一些國(guó)家凈化了豬瘟[9,10]。我國(guó)豬瘟凈化的難點(diǎn)主要存在于生物安全防范不嚴(yán)格、疫苗免疫覆蓋率低、免疫不到位及綜合防控措施不到位等[11,12]。2018 年我國(guó)發(fā)生非洲豬瘟后，集約化進(jìn)程越來(lái)越快，新建豬場(chǎng)生物安全等級(jí)更高，同時(shí)豬瘟標(biāo)記疫苗及相應(yīng)配套的鑒別診斷技術(shù)也開(kāi)始發(fā)展與成熟，在抵御非洲豬瘟疫情的前提下，豬瘟凈化時(shí)機(jī)及條件均已具備[13]。豬瘟凈化按進(jìn)程分為免疫凈化階段和非免疫凈化階段，在免疫凈化階段，疫苗的防治作用仍不容忽視，國(guó)內(nèi)許多規(guī)?；i場(chǎng)一直使用豬瘟兔化弱毒疫苗（C 株）來(lái)防控豬瘟，但由于弱毒疫苗對(duì)保存和運(yùn)輸溫度、免疫程序和免疫時(shí)機(jī)具有較高的要求，同時(shí)不能阻斷病毒的傳播途徑，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體與野生毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體因極其相似而無(wú)法區(qū)別[14,15]，因此，需要通過(guò)豬瘟標(biāo)記疫苗來(lái)實(shí)現(xiàn)豬瘟凈化。區(qū)別于豬瘟活疫苗、豬瘟E2 亞單位疫苗的唯一抗原為豬瘟病毒E2 蛋白，是最主要的保護(hù)性抗原，免疫豬后只產(chǎn)生針對(duì)E2 的抗體。豬場(chǎng)可以通過(guò)對(duì)E2 疫苗免疫豬只的E0 蛋白抗體檢測(cè)，來(lái)區(qū)分免疫和野毒感染豬，進(jìn)而為豬瘟的防控和凈化提供科學(xué)診斷和依據(jù)。本研究通過(guò)2 個(gè)試驗(yàn)分別對(duì)比了豬瘟傳統(tǒng)弱毒疫苗與豬瘟E2 基因工程苗的免疫效果，并進(jìn)一步驗(yàn)證了豬瘟E2 基因工程苗在推進(jìn)豬瘟凈化進(jìn)程中的實(shí)際使用效果，以期為豬瘟凈化提供新的思路。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬瘟E2 基因工程苗、豬瘟傳統(tǒng)弱毒疫苗、英迪康CSFV Erns Ab Test Kit、IDEXX 豬瘟病毒ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，恒溫培養(yǎng)箱KE054N、HNGY-YQ-027、酶標(biāo)儀KE082M、HNGYYQ-082、全自動(dòng)核酸提取儀HNGY-YQ-109、基因擴(kuò)增儀HNGY-YQ-013、電泳儀HNGY-YQ-037、凝膠成像分析系統(tǒng)HNGY-YQ-033 等。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018 年9 月至2022 年3 月在湖南省某集團(tuán)規(guī)模豬場(chǎng)完成。

1.3 試驗(yàn)方法與分組

1.3.1 2 種豬瘟疫苗免疫效果對(duì)比試驗(yàn)

選擇健康的同批次保育仔豬80 頭，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組40 頭豬，試驗(yàn)組接種豬瘟基因工程苗（E2），對(duì)照組接種傳統(tǒng)弱毒疫苗。分別在首免前、首免后21 d 及二免后30 d 采血，進(jìn)行豬瘟抗體水平檢測(cè)，對(duì)比2 種豬瘟疫苗的實(shí)際免疫效果。

1.3.2 豬瘟E2 基因工程苗的免疫效果試驗(yàn)

2019 年3 月后，豬場(chǎng)母豬群使用豬瘟E2 基因工程苗，商品豬繼續(xù)使用豬瘟傳統(tǒng)弱毒苗，持續(xù)跟蹤豬場(chǎng)母豬群更換使用豬瘟E2 基因工程苗后的情況，對(duì)母豬群和商品豬按照不同胎次、不同日齡進(jìn)行采血檢測(cè)，并采集病死豬病料進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估該豬場(chǎng)E2 和E0 的抗體水平和豬瘟野毒感染情況。試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1、表2 和表3。

表1 試驗(yàn)分組

表2 母豬群采血表

表3 商品豬群采血表

1.3.3 評(píng)估指標(biāo)

豬瘟E2 抗體（IDEXX 的阻斷法）；豬瘟E0 抗體（INDICAL 的間接ELISA）；豬瘟病毒核酸PCR（TaKaRa 的RT-PCR）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入、整理和初步分析，用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示。P＜0.05 表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟E2 抗體檢測(cè)結(jié)果

從表4、圖1、圖2、圖3 和圖4 可知，對(duì)照組豬群在首免后21 d 時(shí)豬瘟抗體陽(yáng)性率為25.00%，阻斷率均值為29.40%，離散度為51.80%；試驗(yàn)組豬群在首免后21 d 時(shí)的豬瘟抗體陽(yáng)性率為55.00%，阻斷率均值為40.49%，離散度為27.40%。對(duì)照組豬群在二免后30 d時(shí)豬瘟抗體陽(yáng)性率為80.00%，阻斷率均值為55.48%，離散度為32.70%；實(shí)驗(yàn)組豬群在二免后30 d 時(shí)豬瘟抗體陽(yáng)性率為100%，阻斷率均值為76.32%，離散度為10.3%。

圖1 對(duì)照組豬瘟抗體水平

圖2 試驗(yàn)組豬瘟抗體水平

圖3 豬瘟抗體陽(yáng)性率、保護(hù)率

圖4 豬瘟抗體平均阻斷率、離散度

表4 免疫豬瘟疫苗后E2 抗體檢測(cè)水平

2.2 豬瘟E2 基因工程苗的免疫效果

2.2.1 豬瘟E2 抗體

由表5、圖5、圖6 可知，A 組0～2 胎次母豬的豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%，3 胎次及以上母豬豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%，37 日齡仔豬豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%，58 日齡仔豬豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為91.67%。B 組0～2 胎次母豬的豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%，3 胎次及以上母豬豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%，28 日齡仔豬豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%，62 日齡仔豬豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率為100.00%。

圖5 A 組豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率、平均阻斷率、離散度

圖6 B 組豬瘟E2 抗體陽(yáng)性率、平均阻斷率、離散度

表5 豬瘟E2 抗體檢測(cè)情況表

2.2.2 豬瘟E0 抗體

由表6、圖7 可知，A 組0～2 胎次母豬豬瘟E0 抗體陽(yáng)性率為0%，3 胎次及以上母豬豬瘟E0 抗體陽(yáng)性率為8.33%，37 日齡仔豬豬瘟E0 抗體陽(yáng)性率為0%，58 日齡仔豬豬瘟E0 抗體陽(yáng)性率為8.33%。B 組0～2 胎次母豬豬瘟E0 抗體陽(yáng)性率為0%，3 胎及以上母豬豬瘟E0 抗體陽(yáng)性率為25.00%。

表6 豬瘟E0 抗體檢測(cè)情況表

2.2.3 病豬豬瘟E0 抗體及豬瘟病原PCR 檢測(cè)

由表7 可知，對(duì)5 頭斷奶前病豬（病死豬均采集自3 胎次以上高胎齡母豬所產(chǎn)仔豬）采血檢測(cè)豬瘟E0 抗體，有4 頭豬只呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率80%；而對(duì)病死豬豬瘟病毒核酸檢測(cè)全部為陰性。

3 討論

傳統(tǒng)豬瘟弱毒苗在首免后受母源抗體影響較大，其免疫效果不佳，CSFV 抗體水平低、整齊度差，無(wú)法提供較好的保護(hù)，且在二免后其免疫效果仍不理想。豬瘟E2 基因工程苗首免后在一定程度上仍會(huì)受到母源抗體影響，但相較傳統(tǒng)豬瘟弱毒苗，其受影響較小。且在二免后，CSFV 抗體水平明顯上升，陽(yáng)性率及保護(hù)率均達(dá)100%，抗體水平整齊度好，免疫效果佳，表明豬瘟E2亞單位疫苗在二免后能為豬群提供強(qiáng)有力的保護(hù)。

豬瘟E2 抗體結(jié)果顯示，A、B組母豬E2 抗體的陽(yáng)性率均高達(dá)100%，A 組相較B 組整齊度更好、阻斷率更高，表明豬場(chǎng)更換E2 基因工程苗后，母豬的豬瘟抗體水平較高，且隨著E2 基因工程苗使用時(shí)間越長(zhǎng)，E2 抗體整齊度越好、保護(hù)力越高；A、B 組商品豬的E2抗體水平整體均較好，首免前抗體陽(yáng)性率均為100%，二免前抗體陽(yáng)性率均可達(dá)90%以上，阻斷率稍低，在72%～75%；首免至二免的抗體水平變化說(shuō)明目前豬場(chǎng)的免疫程序較合適，但仔豬首免前抗體水平較高，為減少母源抗體干擾，首免時(shí)間可從當(dāng)前實(shí)施的5 周齡適當(dāng)延后至6～7 周齡。

豬瘟E0 抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B 組0～2 胎次母豬E0 抗體陽(yáng)性率均為0，而3 胎次及以上母豬E0 抗體陽(yáng)性率均超過(guò)5%，這可能是由于豬場(chǎng)有過(guò)豬瘟感染史，且豬場(chǎng)之前使用弱毒疫苗造成的E0 抗體陽(yáng)性率較高，隨著時(shí)間的推移，在母豬群調(diào)整使用豬瘟E2 基因工程苗2 年后E0 抗體陽(yáng)性率從25%下降至8.33%，有明顯下降的趨勢(shì)。

5 頭病死豬的死因均與豬瘟感染無(wú)關(guān)，而其中4 頭豬的豬瘟E0抗體陽(yáng)性，有可能是母豬的豬瘟E0 抗體為陽(yáng)性，通過(guò)乳汁將E0 抗體傳遞給仔豬所造成的。病死豬均采集自3 胎次以上高胎齡母豬所產(chǎn)仔豬，該結(jié)果與上述E0 抗體結(jié)果相符，說(shuō)明3 胎及以上母豬所產(chǎn)仔豬病癥情況更多，且隨著母豬調(diào)整使用E2 苗，E0 抗體陽(yáng)性率下降明顯，病癥減輕。

綜上所述，豬場(chǎng)在更換E2 基因工程苗后不同時(shí)間段監(jiān)測(cè)豬瘟E2 抗體水平均較好，E0 抗體陽(yáng)性率也呈明顯下降的趨勢(shì)，通過(guò)核酸檢測(cè)跟蹤發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)無(wú)豬瘟野毒感染，豬場(chǎng)在免疫豬瘟E2 苗后免疫效果較好，保護(hù)力較強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)評(píng)估E2 基因工程苗的實(shí)際免疫效果，并跟蹤豬場(chǎng)母豬群更換使用E2 苗2 年后的情況，對(duì)比使用不同豬瘟疫苗后豬場(chǎng)的母豬、商品豬的E0 抗體的陽(yáng)性率與病原情況，了解豬場(chǎng)的野毒感染情況，同時(shí)通過(guò)對(duì)比使用豬瘟E2 基因工程苗與使用傳統(tǒng)豬瘟弱毒苗在豬瘟抗體水平及豬瘟野毒感染上的差異，驗(yàn)證了使用豬瘟E2 基因工程苗豬場(chǎng)的豬瘟凈化效果，為指導(dǎo)豬場(chǎng)豬瘟凈化提供參考依據(jù)。

對(duì)比傳統(tǒng)豬瘟弱毒苗，E2 基因工程苗具有明顯優(yōu)勢(shì)，且豬場(chǎng)在更換使用豬瘟E2 基因工程苗后豬瘟E2 抗體水平較好、保護(hù)力高，E0抗體陽(yáng)性率有明顯下降的趨勢(shì)，豬場(chǎng)無(wú)豬瘟野毒感染現(xiàn)象，生產(chǎn)成績(jī)穩(wěn)定，可以繼續(xù)依照調(diào)整后的免疫程序?qū)嵤⑼七M(jìn)豬瘟凈化進(jìn)程。本研究結(jié)果初步驗(yàn)證了E2 基因工程苗在臨床上評(píng)估豬瘟凈化進(jìn)展的可行性，且作為豬瘟凈化的實(shí)例，具有可推廣性。