王佳佳 欒福琛 馬林 董士尚 秦曉春

文章編號(hào)：1671-3559（2023）06-0766-08DOI：10.13349/j.cnki.jdxbn.20230403.002

摘要： 為了獲得可用于X射線衍射分析的嗜熱光合酸桿菌（Chloracidobacterium thermophilum，C.thermophilum）Fenna-Matthews-Olson （FMO）蛋白晶體，進(jìn)一步探究FMO蛋白結(jié)構(gòu)和功能，依次采用高濃度碳酸鈉溶液浸泡、蔗糖密度梯度離心和二乙基氨基乙基葡聚糖凝膠陰離子交換層析方法，直接從嗜熱光合酸桿菌中分離、純化FMO蛋白；利用凝膠過濾層析及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)該蛋白的均一性和純度進(jìn)行檢測；分別使用坐滴法和懸滴法對(duì)蛋白結(jié)晶條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化的蛋白晶體進(jìn)行X射線衍射分析。結(jié)果表明：制得的嗜熱光合酸桿菌FMO蛋白純度較高，性質(zhì)均一；當(dāng)溫度為16 ℃、FMO蛋白質(zhì)量濃度為15.0 g/L、池液中乙酸銨濃度為0.25 mol/L、緩沖液三羥甲基氨基甲烷-氯化氫濃度為0.1 mol/L、pH為9.0，以及2-丙醇體積分?jǐn)?shù)為32%時(shí)，可獲得質(zhì)量較好且最大衍射分辨率為0.235 nm的嗜熱光合酸桿菌FMO蛋白晶體。

關(guān)鍵詞： 生物學(xué)；蛋白質(zhì)；嗜熱光合酸桿菌；分離；純化；結(jié)晶

中圖分類號(hào)： Q-34

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Isolation，Purification，and Crystallization of Fenna-Matthews-Olson

Protein from Chloracidobacterium thermophilum

WANG Jiajia，LUAN Fuchen，MA Lin，DONG Shishang，QIN Xiaochun

（School of Biological Science and Technology，University of Jinan，Jinan 250022，Shandong，China）

Abstract：To obtain crystallized Fenna-Matthews-Olson （FMO） protein from Chloracidobacterium thermophilum （C.thermophilum） that can be used for X-ray diffraction，and further explore structure and function of the FMO protein，the FMO protein was directly isolated and purified? from C.thermophilum by using soaking in high-concentration sodium carbonate solution，sucrose density gradient centrifugation，and diethylaminoethyl cellulose anion exchange chromatography.Gel filtration chromatography and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis were used to test homogeneity and purity of the protein.Crystallization conditions were screened and optimized using sitting-drop method and hanging-drop method，and optimized protein crystals were analyzed by using X-ray diffraction.The results show that the prepared C.thermophilum FMO protein has high purity and uniform properties.When the temperature is 16 ℃，the mass concentration of FMO protein is 15.0 g/L，the concentration of ammonium acetate in the reservoir is 0.25 mol/L，the concentration of the buffer solution trihydroxymethyl aminomethane-HCl is 0.1 mol/L at pH of 9.0，and the volume fraction of 2-propanol is 32%，good quality crystals of the C.thermophilum FMO protein with maximum diffraction resolution of 0.235 nm can be obtained.

Keywords：biology;protein;Chloracidobacterium thermophilum;isolation;purification;crystallization

收稿日期： 2022-11-03??????? 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間：2023-04-04T09∶22∶00

基金項(xiàng)目： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32200206，32270260）；泰山學(xué)者青年專家計(jì)劃項(xiàng)目（tsqn201812079）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目

（ZR2019ZD48，ZR2020QC057）；濟(jì)南市高校院所科研帶頭人工作室項(xiàng)目（2020GXRC058）

第一作者簡介： 王佳佳（1998—），女，山東德州人。碩士研究生，研究方向?yàn)樯锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail：2185567717@qq.com。

通信作者簡介： 董士尚（1987—），男，山東泰安人。講師，博士，研究方向?yàn)樯锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail：bio_dongss@ujn.edu.cn。

秦曉春（1980—），女，山東濟(jì)寧人。教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣夂献饔门c高光效農(nóng)業(yè)。E-mail：bio_qinxc@ujn.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址： https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1378.N.20230403.1645.004.html

光合作用被譽(yù)為“地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)”，為幾乎所有生物提供所需的物質(zhì)和能量。光合作用不僅存在于綠色植物和藻類中，還存在于光合細(xì)菌中。目前已知的光合細(xì)菌除藍(lán)藻外，還可見于其他6個(gè)門，即綠菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、變形菌門、綠彎菌門以及芽單胞菌門［1-3］。其中，前3種光合細(xì)菌的光反應(yīng)中心均以鐵硫簇作為末端電子受體，屬于Ⅰ型光反應(yīng)中心，而后3種光合細(xì)菌（綠彎菌門Candidatus Chlorohelix allophototropha除外［4］）的光反應(yīng)中心均是以醌類作為末端電子受體，屬于Ⅱ型光反應(yīng)中心［5-8］。光合細(xì)菌的光反應(yīng)中心和捕光天線復(fù)合體共同組成光合作用單元，其中捕光天線復(fù)合體捕獲光能，并將激發(fā)能傳遞至光反應(yīng)中心，光反應(yīng)中心負(fù)責(zé)將接受的激發(fā)能轉(zhuǎn)化為自身可以利用與儲(chǔ)存的化學(xué)能［9］。在不同的光合細(xì)菌門中，光合作用單元的結(jié)構(gòu)和功能也各不相同。嗜熱光合酸桿菌（Chloracidobacterium thermophilum，C.thermophilum）是酸桿菌門中最早發(fā)現(xiàn)的一種微需氧光合細(xì)菌［6］，其光合作用單元與綠硫菌類似，包含I型光反應(yīng)中心、外周捕光天線綠小體以及內(nèi)周捕光天線——Fenna-Matthews-Olson （FMO）蛋白。其中綠小體是主要的捕光天線蛋白，可包含多達(dá)2.5×105個(gè)細(xì)菌葉綠素（BChl）分子［10-11］。綠小體吸收的光能不能直接傳遞給光反應(yīng)中心，需要以FMO蛋白為中介才能實(shí)現(xiàn)。FMO蛋白是一種罕見的結(jié)合BChl a的水溶性天線蛋白，處于綠小體與光反應(yīng)中心之間，不僅本身能吸收光能，還能接收來自綠小體的激發(fā)能，并將能量一并傳遞至光反應(yīng)中心［12］。除此之外，F(xiàn)MO蛋白還可以作為間隔物，避免反應(yīng)中心上的鐵硫簇與綠小體發(fā)生碰撞，因此，F(xiàn)MO蛋白在整個(gè)光合作用單元中的地位十分重要。

目前對(duì)于綠硫菌FMO蛋白的研究相對(duì)較多。早期的研究發(fā)現(xiàn)，綠硫菌FMO蛋白主要以同質(zhì)三聚體的形式存在，并且每個(gè)單體結(jié)合7個(gè)BChl a分子［13-15］，但Tronrud等［16］、Chen等［17］的研究表明，在同質(zhì)三聚體相鄰單體之間的界面處，每個(gè)綠硫菌FMO蛋白單體還結(jié)合第8個(gè)BChl a分子，依賴于8個(gè)BChl a分子的精密組裝及其與周圍氨基酸殘基的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)能量水平的準(zhǔn)確調(diào)節(jié)，進(jìn)而引導(dǎo)能量經(jīng)FMO蛋白向光反應(yīng)中心傳遞。與上述研究相比，目前針對(duì)C.thermophilum FMO蛋白的研究相對(duì)較少。盡管空間結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，與綠硫菌FMO蛋白相比，C.thermophilum FMO蛋白中BChl a的結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)保守［18］，但兩者一級(jí)序列的序列同源性僅有約40%，并且在常溫條件下兩者的吸收光譜也存在明顯不同［19］，表明C.thermophilum FMO蛋白在三維空間結(jié)構(gòu)上具有一定的獨(dú)特性。

本文中選取C.thermophilum FMO蛋白為研究對(duì)象，采用生物化學(xué)以及晶體學(xué)的方法成功分離、純化并且結(jié)晶該蛋白，并最終通過X射線衍射測試獲得了其高分辨率的衍射數(shù)據(jù)，為C.thermophilum FMO蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究工作奠定了重要基礎(chǔ)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株

C.thermophilum菌株購自于美國菌種保藏中心（ATCC） 。

1.1.2? 試劑與材料

菌株培養(yǎng)基所用20種L-氨基酸、14種維生素、α-酮戊二酸，大連美侖生物技術(shù)有限公司；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），德國BBI生物科技公司；硫代乙醇酸鈉，阿拉丁試劑（上海）有限公司；BactoTM Peptone（蛋白胨），美國BD公司。分離、純化與結(jié)晶過程中所使用的三羥甲基氨基甲烷（Tris），美國VWR公司；蛋白標(biāo)示物，北京聚合美生物科技有限公司；結(jié)晶篩選試劑盒IndexTM、Crystal ScreenTM、Crystal 2 ScreenTM、PEG/Ion ScreenTM、PEG/Ion 2 ScreenTM，美國Hampton Research公司。

1.1.3? 儀器

GXZ型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；Avanti J-26S XP型高速離心機(jī)、Optima XPN-100型超速離心機(jī)，美國Beckman公司；Scientz-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；JH-02 HC型高壓勻質(zhì)機(jī)，廣州聚能生物科技有限公司；KTA pure25 L1型蛋白純化系統(tǒng)，通用電氣（GE）公司；U-3900H型紫外分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；D8 Venture 型微焦斑轉(zhuǎn)靶單晶衍射儀，德國Bruker公司；上海同步輻射光源（SSRF）蛋白質(zhì)微晶結(jié)構(gòu)光束線（BL18U1）站。

1.2? 方法

1.2.1? C.thermophilum的培養(yǎng)

菌體培養(yǎng)使用嗜熱光合酸桿菌午夜培養(yǎng)基（C.thermophilum midnight medium，CTM-medium）［20-21］。預(yù)先配制970 mL CTM-medium于1 L的藍(lán)口瓶中，以溫度121 ℃滅菌40 min。待自然降溫至70 ℃，向藍(lán)口瓶中添加30 mL經(jīng)孔徑為0.22 μm濾膜過濾的現(xiàn)用現(xiàn)配溶液［0.125 g硫代乙醇酸鈉，0.625 g碳酸氫鈉，0.05 g BactoTM Peptone，20種L-氨基酸各2.5 mg以及14種維生素（生物素、核黃素各0.05 mg，葉酸、煙酸、硫辛酸、維生素B6、對(duì)氨基苯甲酸、D-泛酸鈣、尼克酰胺、鹽酸硫胺、焦磷酸硫胺素、NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、維生素C及維生素B12各0.5 mg）］，混勻，即為CTM-medium。待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃之前，向該藍(lán)口瓶中接入45 mL C.thermophilum菌液。 在溫度為50 ℃、光照強(qiáng)度為50 μmol/（m2·s）的條件下培養(yǎng)7 d，隨后向每瓶培養(yǎng)物中補(bǔ)加20 mL 20種L-氨基酸的混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d 至收獲。

1.2.2? C.thermophilum光合膜的制備

將培養(yǎng)物以8 000g（g為重力加速度，取為9.8 m/s2）的速度離心分離獲得C.thermophilum菌體沉淀，菌體沉淀經(jīng)收菌緩沖液［三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）的濃度為20 mmol/L，pH為7.6］重懸后，獲得C.thermophilum菌體懸浮液（1 g菌體加入約4 mL收菌緩沖液）。首先向菌體懸浮液樣品中加入質(zhì)量濃度為10 g/L的脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）， 然后依次進(jìn)行超聲波破碎與高壓破碎，即樣品先經(jīng)冰浴超聲破碎（超聲作用2 s后間隔3 s，功率為160 W，總時(shí)間為15 min），再經(jīng)低溫高壓勻漿（溫度為4 ℃，壓力為2 000 bar，1 bar=100 kPa）繼續(xù)破碎。 待破碎完全后，低溫高速離心分離（溫度為4 ℃，速度為8 000g，時(shí)間為10 min）獲得上清液，隨后將上清液再進(jìn)行低溫超速離心（溫度為4 ℃，速度為220 000g，時(shí)間為1.5 h）獲得光合膜沉淀。 最后使用收菌緩沖液將所得光合膜沉淀進(jìn)行重懸，得到光合膜樣品。

1.2.3? C.thermophilum FMO蛋白的分離

首先向所得光合膜中緩慢加入高濃度的碳酸鈉溶液（碳酸鈉的濃度為1.6 mol/L，Tris-HCl的濃度為20 mmol/L，pH為7.6）至碳酸鈉的終濃度為0.6 mol/L，低溫低速攪拌孵育過夜（溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為10 r/min，時(shí)間為16 h）。次日，低溫高速離心（溫度為4 ℃，速度為220 000g，時(shí)間為1.5 h ）收集上清液樣品并于低溫條件下離心分離（溫度為4 ℃，速度為6 000g，時(shí)間為3～4 h）濃縮、更換樣品液至不含碳酸鈉的A液（Tris-HCl的濃度為20 mmol/L，pH為8.8）中。隨后將樣品液體積濃縮至小于2 mL并將其緩慢加至蔗糖濃度梯度溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～40%）最上層，然后進(jìn)行低溫超速離心分離（溫度為4 ℃，速度為220 000g，時(shí)間為18 h），收集蔗糖梯度中不同顏色的條帶，通過全光譜掃描分析吸收特征峰確定目標(biāo)蛋白所在的條帶位置。

1.2.4? C.thermophilum FMO蛋白的純化

收集包含目標(biāo)蛋白的條帶，用A液等體積稀釋后進(jìn)行二乙基氨基乙基葡聚糖凝膠（dicthylaminoethyl dextran gel，DEAE）（柱體積為25 mm×50 mm，表面直徑×高度）陰離子交換層析（體積流量為1.0 mL/min）。 期間采用含有高濃度氯化鈉的B液（氯化鈉的濃度為1.0 mol/L，Tris-HCl的濃度為20 mmol/L，pH為8.8）進(jìn)行蛋白洗脫，觀察離子交換層析過程中蛋白洗脫峰值的變化，并分別收集各個(gè)蛋白洗脫峰溶液，使用全光譜分析確定目標(biāo)蛋白所在的峰位。最后將獲得的C.thermophilum FMO蛋白樣品濃縮并更換樣品溶液至A液中保存。

1.2.5? C.thermophilum FMO蛋白的均一性和純度鑒定

對(duì)C.thermophilum FMO蛋白樣品通過分子篩（Superose 6 Increase 10/300型）進(jìn)行凝膠過濾層析（體積流量為0.5 mL/min，最大壓強(qiáng)為2.5 MPa），觀察蛋白峰形狀及出峰位置，判斷C.thermophilum FMO蛋白的均一性。收集包含目標(biāo)蛋白的洗脫峰，使用全光譜分析以及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）判斷所得C.thermophilum FMO蛋白的純度。

1.2.6? C.thermophilum FMO蛋白結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化

利用坐滴法進(jìn)行C.thermophilum FMO蛋白樣品結(jié)晶條件的初步篩選。篩選所選用的蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為15.0 g/L，池液與蛋白質(zhì)溶液按照

體積比1∶1混合，結(jié)晶溫度為16 ℃，結(jié)晶試劑盒為IndexTM、Crystal ScreenTM、Crystal 2 ScreenTM、PEG/Ion ScreenTM和PEG/Ion 2 ScreenTM（共計(jì)288種條件）。待晶體長出后，選取形狀規(guī)則、體積較大的晶體所對(duì)應(yīng)的生長條件進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化，即通過對(duì)C.thermophilum FMO蛋白溶液濃度，池液中沉淀劑濃度、緩沖試劑種類、pH以及結(jié)晶生長溫度進(jìn)行梯度調(diào)整，最終獲得可用于X射線衍射數(shù)據(jù)收集的C.thermophilum FMO蛋白質(zhì)晶體。為了驗(yàn)證所得晶狀物為C.thermophilum FMO蛋白晶體，將所得晶狀物從生長溶液中取出并進(jìn)行SDS-PAGE檢測分析。

1.2.7? C.thermophilum FMO蛋白晶體的X射線衍射分析

首先，在顯微鏡下選取C.thermophilum FMO蛋白晶體，快速置于含有體積分?jǐn)?shù)為30%甘油的防凍液（包含池液成分和甘油）中靜置2～3 s；然后，使用微焦斑轉(zhuǎn)靶單晶衍射儀進(jìn)行初步的衍射能力測試，選擇衍射能力較好的晶體迅速置于液氮中保存；最后于SSRF BL18U1光束線收集衍射數(shù)據(jù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? C.thermophilum FMO蛋白的純化

C.thermophilum光合膜經(jīng)濃度為0.6 mol/L的碳酸鈉溶液處理后獲得含有FMO蛋白的粗制品。為了提高C.thermophilum FMO蛋白的均一性和純度，先后使用蔗糖濃度梯度離心和DEAE陰離子交換層析進(jìn)行精細(xì)純化。 過夜孵育的光合膜樣品經(jīng)蔗糖濃度梯度離心后可得到3條明顯條帶，分別記為條帶1、2、3，如圖1（a）所示，它們常溫下吸收光譜分別如圖1（b）、（c）、（d）所示。 由圖可看出： 條帶1的吸收光譜包含波長743 nm處的吸收峰（綠小體中色素的特征吸收峰），推測條帶1的主要成分是綠小體；條帶2的吸收光譜包含波長598.5、797.5 nm處的吸收峰（FMO蛋白中色素的特征吸收峰），推測條帶2主要成分為FMO蛋白；條帶3的吸收光譜包含波長668.5、729、808 nm處的吸收峰，目前無法根據(jù)吸收峰判斷其組分。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，條帶2的吸收光譜中除存在FMO蛋白色素的特征吸收峰外，在波長743 nm處還有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，因此推測條帶2是FMO蛋白與綠小體的混合物。為了除去綠小體以提高FMO蛋白的純度，對(duì)條帶2樣品進(jìn)行DEAE陰離子交換層析純化。層析結(jié)果出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰，如圖2（a）所示，分別收集并進(jìn)行吸收光譜測定，如圖2（b）、（c）、（d）所示。 在3個(gè)洗脫峰中，僅峰Ⅱ的吸收光譜在波長598.5、797.5 nm處出現(xiàn)C.thermophilum FMO蛋白的特征吸收峰，并且與層析之前的樣品吸收光譜［見圖1（c）］相比，來自綠小體的波長743 nm處的特征吸收峰明顯降低，因此初步確定峰Ⅱ所對(duì)應(yīng)樣品為去除綠小體的FMO蛋白樣品。 為了進(jìn)一步證實(shí)吸收峰為目標(biāo)蛋白C.thermophilum FMO蛋白，收集峰Ⅱ并對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在電泳膠上表觀分子質(zhì)量約為42 kDa處出現(xiàn)1條主要條帶（其他蛋白條帶不明顯），其分子質(zhì)量與C.thermophilum FMO蛋白單體蛋白的相符，表明峰Ⅱ即為純度較高的C.thermophilum FMO蛋白樣品的吸收峰。

2.2? C.thermophilum FMO蛋白的均一性和純度鑒定

將DEAE陰離子交換層析純化后的C.thermophilum FMO蛋白進(jìn)行凝膠過濾層析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在出峰體積約13.25 mL處出現(xiàn)強(qiáng)洗脫峰且峰形較為對(duì)稱，說明蛋白均一性較好。將凝膠過濾層析的上層樣品（DEAE陰離子交換層析獲得的峰Ⅱ）與洗脫峰蛋白溶液均進(jìn)行吸收光譜測定，發(fā)現(xiàn)二者吸收光譜基本一致，說明凝膠過濾層析前后的樣品成分變化不大。此外，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，純化蛋白的表觀分子質(zhì)量（42 kDa）與C.thermophilum FMO蛋白的理論分子質(zhì)量相一致，并且純度與DEAE陰離子交換層析峰Ⅱ的純度相差不大（如圖3所示）。上述結(jié)果表明，經(jīng)DEAE陰離子層析足夠獲得純度和均一性良好的C.thermophilum FMO蛋白，可用于后續(xù)的晶體篩選實(shí)驗(yàn)，無須進(jìn)行進(jìn)一步凝膠過濾層析。

2.3? C.thermophilum FMO蛋白結(jié)晶條件的篩選與優(yōu)化

在溫度為16 ℃的恒溫條件下，使用蛋白結(jié)晶篩選試劑盒對(duì)C.thermophilum FMO蛋白樣品進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選。結(jié)果顯示，F(xiàn)MO蛋白多數(shù)條件不能結(jié)晶，僅有12種條件可以產(chǎn)生綠色的FMO蛋白質(zhì)晶體（見表1）。對(duì)所得的12種結(jié)晶條件進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后選定其中3種（池液名稱分別為IndexTM56、Crystal 2 ScreenTM19、Crystal ScreenTM39）結(jié)晶時(shí)間較短、晶體生長較大且形狀較為規(guī)則的結(jié)晶條件進(jìn)行后續(xù)的晶體優(yōu)化。

優(yōu)化過程選用懸滴法，通過對(duì)C.thermophilum FMO蛋白的濃度、結(jié)晶pH、沉淀劑濃度、緩沖液種類以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行多輪的優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，池液名稱為IndexTM 56、Crystal 2 ScreenTM 39的優(yōu)化效果較差，C.thermophilum FMO蛋白晶體的大小及形狀均未改善，并且基于這2種條件所優(yōu)化的晶體結(jié)晶率較低，因此，后續(xù)僅選定池液名稱為Crystal ScreenTM 19的結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化。具體優(yōu)化結(jié)晶條件如下：蛋白質(zhì)量濃度為10、15、18 g/L；2-丙醇的體積分?jǐn)?shù)為20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、38%、42%；pH為7.5、8.0、8.5、9.0；緩沖液選擇Tris-HCl和HEPES；培養(yǎng)溫度為4、12、16 ℃。針對(duì)上述5個(gè)不同變量，每次僅改變其中一個(gè)變量進(jìn)行優(yōu)化。

經(jīng)過多輪優(yōu)化，最后在溫度為16 ℃，F(xiàn)MO蛋白質(zhì)量濃度為15.0 g/L，池液中乙酸銨的濃度為0.25 mol/L，緩沖液Tris-HCl的濃度為0.1 mol/L，pH為9.0，2-丙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%的條件下獲得了體積較大、形狀規(guī)則的綠色晶體，如圖4（a）、（b）所示。 將晶體從池液中取出后經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4（c）。 由圖發(fā)現(xiàn)，條帶所示分子質(zhì)量大小與C.thermophilum FMO蛋白單體分子質(zhì)量大小一致，表明所得的綠色晶體即為C.thermophilum FMO蛋白質(zhì)晶體。

2.4? C.thermophilum FMO蛋白的X射線衍射

使用微焦斑轉(zhuǎn)靶單晶衍射儀對(duì)優(yōu)化后的C.thermophilum FMO蛋白晶體進(jìn)行衍射分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晶體最高衍射分辨率達(dá)0.326 nm。 將最高分辨率在0.400 nm以內(nèi)的FMO蛋白晶體回收并凍存于液氮中，于SSRF BL18U1光束線進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，得到一套最高衍射分辨率達(dá)0.235 nm ［見圖4（d）］的C.thermophilum FMO蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)，進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理以及結(jié)構(gòu)解析工作正在進(jìn)行。

3? 結(jié)論

基于Tsukatani等［19］針對(duì)C.thermophilum FMO蛋白的制備流程，本文中對(duì)C.thermophilum FMO蛋白樣品進(jìn)行了分離和純化，并利用坐滴法和懸滴法對(duì)C.thermophilum FMO蛋白進(jìn)行了結(jié)晶條件的初步篩選和優(yōu)化，得到以下主要結(jié)論：

1）本文中對(duì)C.thermophilum FMO蛋白的分離和純化實(shí)驗(yàn)流程更短，將原來需要5 d的制備時(shí)間縮短至3 d，確保了所得蛋白性質(zhì)的穩(wěn)定；增加了蔗糖濃度梯度離心分離步驟，該步驟可以除去絕大多數(shù)的綠小體和其他雜質(zhì)，降低了后續(xù)純化的難度；通過DEAE陰離子交換層析獲得了電荷性質(zhì)均一、純度較高的目標(biāo)蛋白，整個(gè)純化過程無須使用進(jìn)一步的凝膠過濾層析，減少了C.thermophilum FMO蛋白的損失，提高了目標(biāo)蛋白收率。

2）從288種結(jié)晶條件中篩選出多達(dá)12種晶體生長條件，獲得了形狀規(guī)則、大小均一的結(jié)晶質(zhì)量相對(duì)較好的C.thermophilum FMO蛋白晶體。

3）在顯微鏡下仍然可以觀察到C.thermophilum FMO蛋白晶體的兩端存在較多毛刺狀的微小晶體，表明該蛋白晶體可能存在多晶問題，后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化。 本文中的研究為進(jìn)一步解析C.thermophilum FMO蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，明確其結(jié)構(gòu)特征、色素分布以及可能能量傳遞途徑奠定了重要基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］THIEL V，TANK M，BRYANT D A.Diversity of chlorophototrophic bacteria revealed in the omics era［J］.Annual Review of Plant Biology，2018，69（1）：21.

［2］THWEATT J L，CANNIFFE D P，BRYANT D A.Biosynthesis of chlorophylls and bacteriochlorophylls in green bacteria［J］.Advances in Botanical Research，2019，90：35.

［3］BRYANT D A，F(xiàn)RIGAARD N U.Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated［J］.Trends in Microbiology，2006，14（11）：488.

［4］TSUJI J M，SHAW N A，NAGASHIMA S，et al.Anoxygenic phototrophic chloroflexota member uses a type I reaction center［J］.Molecular Biology and Evolution，2020，23 （11）：2001.

［5］GOLBECK J H.Shared thematic elements in photochemical reaction centers［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1993，90 （5）：1642.

［6］BRYANT D A，GARCIA COSTAS A M，MARESCA J A，et al.Candidatus Chloracidobacterium thermophilum：an aerobic phototrophic Acidobacterium［J］.Science，2007，317（5837）：523.

［7］ZENG Y H，F(xiàn)ENG F Y，HAHA M，et al.Functional type 2 photosynthetic reaction centers found in the rare bacterial phylum Gemmatimonadetes［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（21）：7795.

［8］ORF G S，GISRIEL C，REDDING K E.Evolution of photosynthetic reaction centers：insights from the structure of the heliobacterial reaction center［J］.Photosynthesis Research，2018，138（1）：11.

［9］ALLEN J P，WILLIAMS J C.Photosynthetic reaction centers［J］.FEBS Letters，1998，438（1/2）：5.

［10］ORF G S，BLANKENSHIP R E.Chlorosome antenna complexes from green photosynthetic bacteria［J］.Photosynth Research.2013，116（2/3）：315.

［11］FRIGAARD N-U，BRYANT D A.Chlorosomes：antenna organelles in photosynthetic green bacteria ［M］//JESSUP M S.Complex Intracellular Structures in Prokaryotes.Berlin： Springer-Verlag，2006：89.

［12］WEN J Z，ZHANG H，GROSS M L，et al.Membrane orientation of the FMO antenna protein from Chlorobaculum tepidum as determined by mass spectrometry-based footprinting［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（15）：6134.

［13］FENNA R E，MATTHEWS B W，OLSON J M，et al.Structure of a bacteriochlorophyll-protein from the green photosynthetic bacterium Chlorobium limicola：crystallographic evidence for a trimer［J］.Journal of Molecular Biology，1974，84（2）：231.

［14］FENNA R E，MATTHEWS B W.Chlorophyll arrangement in bacteriochlorophyll protein from Chlorobium limicola［J］.Nature，1975，258：573.

［15］MATTHEWS B W，F(xiàn)ENNA R E，BOLOGNESI M C，et al.Structure of a bacteriochlorophyll a-protein from the green photosynthetic bacterium Prosthecochloris aestuarii［J］.Journal of Molecular Biology，1979，131（2）：259.

［16］TRONRUD D E，WEN J，GAY L，et al.The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria［J］.Photosynthesis Research，2009，100（2）：79.

［17］CHEN J H，WU H J，XU C H，et al.Architecture of the photosynthetic complex from a green sulfur bacterium［J］.Science，2020，370（6519）：1.

［18］WEN J Z，TSUKATANI Y，CUI W D，et al.Structural model and spectroscopic characteristics of the FMO antenna protein from the aerobic chlorophototroph，Candidatus Chloracidobacterium thermophilum［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2010，1807（1）：157.

［19］TSUKATANI Y，WEN J Z，BLANKESHIP R E，et al.Characterization of the FMO protein from the aerobic chlorophototroph，Candidatus Chloracidobacterium thermophilum［J］.Photosynthesis Research，2010，104（2/3）：201.

［20］WHITMAN W B.Bergeys manual of systematics of archaea and bacteria［M］.New York：John Wiley Sons，2015.

［21］TANK M，THIEL V，WARD D M，et al.A panoply of phototrophs：an overview of the thermophilic chlorophototrophs of the microbial mats of alkaline siliceous hot springs in Yellowstone National Park，WY，USA［M］//PATRICK C H.Modern Topics in the Phototrophic Prokaryotes.Switzerland： Springer，Cham，2017：87.

（責(zé)任編輯：于海琴）